Чтобы начать покрытие антигеном, разбавьте овальбумин до пяти микрограммов на миллилитр с помощью буфера для покрытия. Покройте 96-луночный планшет ИФА 100 микролитрами раствора овальбумина на лунку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день пять раз промойте лунки с ПБСТ.
Закройте лунки 250 микролитрами 1% BSA PBST при температуре 37 градусов Цельсия на два часа. Чтобы приготовить разведение сыворотки 1000 X, сначала разбавьте 20 микролитров сыворотки до одного миллилитра, используя 0,5% BSA PBST. Затем удалите 25 микролитров аликвоты сыворотки и разбавьте ее до 500 микролитров, используя 0,5% BSA PBST.
Добавьте 200 микролитров сыворотки, разведенной до 1000 Х, в первый ряд покрытой пластины. Затем добавьте 100 микролитров 0,5% BSA PBST во все лунки, кроме лунок в первом ряду. Переложите 100 микролитров из первого ряда во второй ряд, и перемешайте 10 раз.
Чтобы создать различные концентрации сыворотки для обнаружения IgG, отбросьте 100 микролитров жидкости из последнего ряда. Затем разбавьте мышей вагинальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, жидкости для промывания носа 0,5% BSA PBST и жидкость для промывания тонкого кишечника 20% сывороткой плода из PBST. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.
Промойте лунки пять раз PBST. Добавьте 100 микролитров конъюгированного козьего антитела против мышей HRP в соответствующие лунки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. После пятикратной промывки лунок PBST добавьте 100 микролитров субстрата TMB ELISA и выдерживайте в легком защищенном помещении в течение пяти минут.
Добавьте 100 микролитров 450-нанометрового стоп-раствора, чтобы завершить реакцию. Измерьте поглощение на 450 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов. Рассчитайте титр антител, определяющий значение положительного ответа, в 2,1 раза превышающее сывороточное значение контрольной группы мышей.
Наноэмульсионная адъювантная вакцина значительно увеличила титры антител IgG, IgG1 и IgG2a, специфичных для овальбумина, в сыворотке. Уровни специфического IgA в жидкости для промывания влагалища и жидкости для лаважа тонкой кишки были значительно повышены при адъюванции овальбумина катионной наноэмульсией, инкапсулированной ретиноевой кислотой.
