Выделение одиночных клеток из органоидов мозга человека для секвенирования РНК одиночных клеток

Для начала соберите до пяти органоидов человеческого мозга, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в одной лунке из шести лунок. Отсасывайте избыток питательных сред и промойте органоиды один раз с помощью PBS. С помощью скальпеля тщательно измельчите органоиды.

Добавьте смесь ферментов к измельченным органоидам и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 20% кислорода и 5% углекислого газа при 90 оборотах в минуту в течение 10-15 минут. Смешайте органоидную суспензию с помощью наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров. Затем добавьте две ферментные смеси и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-15 минут.

Остановите диссоциацию, добавив 10 миллилитров стоп-раствора. Отфильтруйте клеточную суспензию на сетчатом фильтре 70 микрон. Центрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в четырех миллилитрах холодной 0,04% БСА. Теперь отфильтруйте клеточную суспензию на 40-микронном сетчатом фильтре и подсчитайте клетки на счетчике клеток. Центрифугируйте необходимое количество клеточной суспензии, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в NSB плюс среду в соответствии с инструкцией по набору scRNA-Seq на основе микрофлюидики.