Выделение одиночных ядер из органоидов мозга человека для секвенирования одноядерных РНК

Для начала перенесите четыре органоида человеческого мозга, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в шестилуночный планшет, содержащий охлажденный PBS. Разрежьте каждый органоид на четыре части. С помощью ножниц отрежьте кончик наконечника пипетки объемом 1000 микролитров и используйте его для переноса кусочков органоида в двухмиллилитровый надув.

Полностью отсадите PBS и добавьте один миллилитр буфера для лизиса NP-40. Трижды измельчите органоиды с помощью пестика А, а затем пестика В. Перелейте суспензию в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Промойте шезлонг одним миллилитром буфера для лизиса и переложите раствор в центрифужную пробирку.

После пяти минут инкубации при комнатной температуре центрифугируйте органоидную суспензию при 500 G в течение пяти минут. Отсадите надосадочную жидкость, оставив в трубке 50 микролитров. Добавьте в пробирку один миллилитр среды NSB Plus.

А через пять минут перемешиваем для ресуспензии гранулы. После приготовления градиента Перколла в пробирке сверху нанесите слой органоидной суспензии. Затем центрифугируйте слоистую органоидную суспензию при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в среде NSB Plus. Отфильтруйте раствор ядер на клеточном фильтре 40 микрон. Затем окрасьте ядра с помощью DAPI и подсчитайте их в камере Нейбауэра.

Центрифугируйте необходимое количество раствора ядер и ресуспендируйте гранулу в среде NSB Plus в соответствии с инструкцией по набору snRNA-seq на основе микрофлюидики.