Для начала культивируйте кишечную палочку в 5 миллилитрах среды Лурии-Бертани, или LB, в стерильной пробирке из полистирола или стекла. Инкубируйте пробирку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании при 200 оборотах в минуту. Субкультура: выращенная в ночное время культура 1 к 50 в 100 миллилитрах LB в конической колбе.
Инкубируют культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин примерно 1,5 часа. Затем добавляют 100 микролитров фагового запаса Т4 с высоким титром в культуру E.coli и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании в течение трех часов. Как только лизат фага Т4 станет прозрачным, соберите их в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Центрифугируйте лизаты при концентрации 4 000 г в течение 20 минут, чтобы гранулировать оставшиеся бактерии и клеточный мусор. Процедите получившуюся надосадочную жидкость с помощью нейлонового фильтра 0,22 микрона и соберите фильтрат в новую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте 0,1 объема хлороформа к отфильтрованному лизату фага Т4, чтобы убить оставшиеся бактерии и предотвратить их рост.
Недолго перемешайте и инкубируйте лизат при комнатной температуре в течение десяти минут. Центрифугируют лизат при концентрации 4 000 г в течение пяти минут, чтобы отделить хлороформ от лизата. С помощью серологической пипетки аккуратно перенесите верхний слой лизата в новую пробирку объемом 50 миллилитров.
Добавьте 13 миллилитров фагового лизата в верхний резервуар 100-килодальтонного центробежного фильтрующего устройства. Концентрируйте лизат в концентрации 4 000 г в течение пяти минут или до тех пор, пока большая часть лизата не пройдет через фильтр. С помощью пипетки P200 или P1000 осторожно выпийте оставшиеся 2 миллилитра лизата вверх и вниз в верхнем резервуаре, чтобы прочистить мембрану фильтра.
Выбросьте фильтрат из нижнего резервуара в контейнер для отходов. Повторите концентрацию и оставьте примерно 2 миллилитра концентрированного фага в верхнем резервуаре. После последнего отжима аккуратно пипеткой распределите оставшийся лизат вверх и вниз в верхнем резервуаре.
Чтобы промыть лизат фага, добавьте 12 миллилитров солевого магниевого буфера в верхний резервуар и центрифугируйте при 4 000 г в течение 10 минут. После второй промывки ресуспендируйте оставшиеся 2 миллилитра лизата в буфере SM до окончательного объема 10 миллилитров. Перелейте лизат в пробирку объемом 50 миллилитров и храните при температуре 4 градуса по Цельсию.
Для удаления загрязняющих эндотоксинов добавляют 0,4 объема 1-Октанола к общему объему лизата. Запечатайте крышку пробирки герметизирующей пленкой и встряхивайте при 120 об/мин в течение одного часа с последующей инкубацией при 4 градусах Цельсия в течение 1,5 часов без встряхивания. Центрифуга для отделения очищенного эндотоксином лизата от 1-октанола.
Осторожно удалите как можно больше 1-октанола с помощью пипетки P1000 и выбросьте его в соответствующий контейнер для отходов. Используя иглу 18-го калибра и шприц объемом 10 миллилитров, соберите лизат фага под оставшимся слоем 1-октанола. Переложите 1 миллилитр лизата фага Т4 в стерильные 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки.
Вакуумируйте пробирки с открытыми крышками на скорости 4 000 г, чтобы испарить остаточный 1-октанол из лизата. Приготовьте серийное разведение лизата фага с коэффициентом 10, затем нанесите 5 микролитров каждого разведения на планшеты с агаром LB и инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день подсчитайте бляшки, чтобы рассчитать единицы, образующие бляшки, или ФОУ.
Разбавьте полученный лизат и буфер СМ до нужной концентрации и повторите для подтверждения. Храните концентрированный лизат при температуре 4 градуса Цельсия до использования.
