Для начала поместите усыпленную мышь на хирургическую платформу. Используйте хирургические ножницы, чтобы деликатно удалить веки. Затем с помощью изогнутого пинцета слегка надавите на противоположные стороны глазницы, заставляя глаз выпячиваться наружу.
Используйте нож для лечения катаракты, чтобы сделать аккуратный надрез на роговице, и используйте изогнутый пинцет, чтобы осторожно извлечь хрусталик. Затем с помощью изогнутого пинцета с тупыми кончиками перенесите линзы в 60-миллиметровую пластиковую чашку для культивирования, содержащую пять миллилитров стерильного ДПБС и гентамицина. Аккуратно промойте линзы раствором DPBS, содержащим гентамицин.
После завершения процесса промывки поместите линзу на лист фильтровальной бумаги и дайте ей высохнуть. После того, как хрусталик достаточно высохнет, осторожно перенесите его на крышку чашки Петри, чтобы подготовиться к извлечению капсулы хрусталика. Затем поверните линзу вверх, убедившись, что передний сегмент обращен вверх.
Удерживая переднюю капсулу пинцетом, используйте щипцы капсулогексиса в доминирующей руке, чтобы создать небольшой разрыв. Осторожно потяните два инструмента в противоположных направлениях, чтобы извлечь капсулу. Поместите капсулу в DPBS до тех пор, пока не будут завершены все вскрытия хрусталика.
После этого осторожно перенесите капсулу объектива на шестилуночную пластину. Добавьте один миллилитр 0,05%-ного раствора трипсина в каждую лунку, чтобы инициировать процесс ферментативного разложения. Осторожно перемешайте раствор трипсина, чтобы обеспечить равномерное проникновение.
Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур и дайте капсуле перевариться в течение 8-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем с помощью ножниц для препарирования тщательно измельчите переваренную капсулу хрусталика, чтобы способствовать разделению клеток. Добавьте 0,5 миллилитра питательной среды, содержащей 10% FBS, для гашения трипсина.
Переложите образцы тканей в центрифугируемую пробирку и центрифугу при 1000 G в течение пяти минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не повредив гранулу клетки. Используйте один миллилитр питательной среды для ресуспендирования клеток и посева клеток в 24-луночный планшет.
Фазированное контрастное изображение культивируемых эпителиальных клеток хрусталика показало, что между третьим и пятым днем клетки начали фазу пролиферации. Фазы быстрого роста и логарифмической пролиферации наблюдались между 7-м и 10-м днем.
