Для начала приготовьте гель SDS-PAGE. Раскрутить размороженный маркер и подготовленные образцы для анализа клеточного термосдвига. Добавьте 2,5 микролитра маркера в первую лунку и по 20 микролитров проб в каждую из оставшихся лунок.
Затем запустите гель при напряжении 80 вольт. Затем добавьте в стакан 850 миллилитров сверхчистой воды, 100 миллилитров безводного этанола и 50 миллилитров буфера для быстрого переноса и хорошо перемешайте. Разрежьте мембрану из поливинилиденфторида или ПВДФ в соответствии с размером геля и отметьте ее.
Затем замочите его в метаноле на 30 секунд, чтобы активировать. Поместите зажимы для переноса, губку и три слоя фильтровальной бумаги в лоток, содержащий буфер для переноса. После завершения электрофореза вылейте раствор электрофореза из устройства для электрофореза и снимите пластину.
Аккуратно удалите гель пластиковым ножом и разрежьте его, чтобы четко визуализировать белковый маркер и целевые белки. После промывки геля в трансмембранном растворе разложите его плашмя на фильтровальной бумаге. Окуните активированную мембрану из ПВДФ в раствор для переноса.
Держите помеченную сторону пинцетом и накройте гель лицевой стороной вниз. Затем поместите собранную передаточную установку в передаточный бак. Добавьте оставшийся трансмембранный раствор в трансмембранную кассету.
Отрегулируйте ток и время и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать передачу при комнатной температуре. Теперь добавьте шесть миллилитров 5%-ного раствора БСА с TBST в инкубационную коробку. После завершения переноса снимите мембрану PVDF с установки, зажимая маркерную сторону, и поместите ее в инкубационный бокс.
После извлечения раствора БСА из коробки инкубатора добавляют шесть миллилитров первичного антитела. Поместите инкубационный бокс в пенопластовую коробку с пакетами со льдом на ночь во время встряхивания. На следующий день соберите первичное антитело в пробирку, а мембрану промойте шестью миллилитрами раствора TBST.
После этого добавьте шесть миллилитров вторичного антитела в инкубационную коробку. В конце инкубации соберите вторичное антитело и пять раз промойте мембрану TBST, как показано ранее. Смешайте равные объемы хемилюминесцентных реагентов А и В. Откройте систему визуализации геля.
Нажмите на образцы, проверьте калибровку и дождитесь завершения калибровки. Затем нажмите на маркер и проверьте калибровку. Теперь поднимите пинцетом маркерную сторону полоски и полностью погрузите в раствор хемилюминесцентного реагента.
Зажмите одну сторону маркера так, чтобы полоска была помещена в тепловизор лицевой стороной вниз, и закройте крышку тепловизора. Установите время экспозиции равной одной секунде и нажмите Захват. Нажмите «Сохранить».
Назовите изображение и сохраните его как файл TIFF. Анализ клеточного теплового сдвига показал, что ксантатин значительно смещает термическую стабильность белка Keap1 в диапазоне температур от 48 до 57 градусов Цельсия по сравнению с группой диметилсульфоксида.
