Для начала добавьте 264,7 необработанных клеток в 100-миллиметровую чашку для культивирования и инкубируйте с шестью миллилитрами DMEM при 37 градусах Цельсия с влажностью 95% и углекислым газом 5%. Как только клетки достигнут 80% конфлюенции, аспирируйте старую среду, затем промойте клетки два раза двумя миллилитрами PBS, нагретыми до комнатной температуры. Затем добавьте два миллилитра PBS в каждую посуду, содержащую клетки, и перемешайте их.
Соберите клетки в две 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, затем центрифугируйте при 377 G в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в двух миллилитрах PBS. Теперь заморозьте микроцентрифужные пробирки в жидком азоте до образования белого твердого вещества и сразу же разморозьте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.
Центрифугируйте пробирки при 12 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем возьмите две микроцентрифужные пробирки, одну со 100 микромолярным ксантатином, а другую с равным объемом диметилсульфоксида. Добавьте 450 микролитров центрифугированной надосадочной жидкости в каждую пробирку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Затем переведите по 60 микролитров надосадочной жидкости из каждой микроцентрифужной пробирки в 14 ПЦР-пробирок. Нагревайте пробирки одновременно при разной температуре в течение трех минут двумя ПЦР-пробирками при каждой температуре. Затем поместите пробирки в центрифугу.
Теперь возьмите 48 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки и добавьте ее в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Добавьте в каждую пробирку 12 микролитров белкового загрузочного буфера SDS-PAGE. Нагрейте вихревые образцы на водяной бане при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут.
