Анализ митохондриальной функции в индуцированных Ethidium bromide миниатюрных колониях Candida glabrata

Чтобы приступить к культивированию Candida glabrata, разложите все экспериментальные материалы на рабочей площадке. Выберите одну колонию C.glabrata из пептонной декстрозы дрожжей или агаровой пластины YPD. И перенесите его в стеклянную пробирку, содержащую 3 миллилитра среды YPD.

Инкубировать в течение 14–16 часов при температуре 25 градусов Цельсия с встряхиванием при 155 об/мин. После инкубации разведите культуру в свежем YPD до получения оптической плотности 600 нанометров 0,1. Инкубировать разведенную культуру при температуре 25 градусов Цельсия в течение шести часов, встряхивая при 155 об/мин.

Приготовьте дрожжевую суспензию до оптической плотности при 600 нанометрах от 0,1 в YPD до 3 миллилитров. Добавьте 30 микролитров бромида этидия и инкубируйте дрожжевую суспензию в течение ночи при температуре 25 градусов Цельсия при 155 об/мин под углом 45 градусов. На следующий день отрегулируйте оптическую плотность культуры до 0,65 со свежей средой YPD.

В 96-луночный планшет добавьте 20 микролитров дрожжевой суспензии к 180 микролитрам PBS на лунку для десятикратного разбавления. Планшет 20 микролитров каждого разведения на четырех квадрантах агаровой пластины YPD. Инкубируйте тарелку в течение ночи при 37 градусах Цельсия.

На следующий день выберите квадранты с пятью до 80 колониями и добавьте 20 микролитров 20% трифенилтетразолия. И добавьте 20 микролитров 20% трифенилтетразолия хлорида непосредственно в центр каждой колонии. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–40 минут.

Сканируйте пластины с разрешением 1200 точек на дюйм с помощью 48-битного полноцветного оптического сканера. Агент, интеркалирующий ДНК, бромид этидия, эффективно индуцирует миниатюрных мутантов C.glabrata.