Для начала поместите культуру Candida Glabrata и YPD на рабочую платформу. Отрегулируйте оптическую плотность суспензии дрожжевых клеток на 600 нанометрах до 0,65 со средой YPD. Смешайте один миллилитр дрожжевой суспензии со 111 микролитрами 2%-ной бенгальской розы в круглой тюбике с крышкой.
Инкубируйте смесь при температуре 25 градусов Цельсия в течение 15 минут, вращая под углом 45 градусов со скоростью 155 об/мин. После инкубации переложите смесь в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при 16, 100 г в течение 2,5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно соскребите пробирку пять раз, чтобы снова суспендировать гранулу.
Промойте суспензию PBS четыре раза, чтобы удалить всю бенгальскую розу. После окончательной промывки перелейте по 200 микролитров дрожжевой суспензии, загруженной Rose Bengal, в каждую из трех лунок в 96-луночной пластине. Расположите табличку на фотодинамической световой системе так, чтобы светодиодные лампы светили зеленым светом снизу.
Активируйте светодиодную световую систему, чтобы обеспечить дозу фотодинамической терапии 4,38 джоуля на квадратный сантиметр в течение двух минут. После облучения добавьте 20 микролитров дрожжевой суспензии в лунку, содержащую 180 микролитров PBS, создавая десятикратное разбавление. Для каждого коэффициента разбавления наберите 20 микролитров на квадрант на шнековых пластинах YPD.
Переверните пластину и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день подсчитайте количество колоний в каждом квадранте. Используя приведенную формулу, рассчитайте колониеобразующие единицы на миллилитр.
Добавьте 20 микролитров 20% трифенилтетразолия хлорида непосредственно в центр каждой колонии и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–40 минут. Сканируйте планшеты с разрешением 1 200 точек на дюйм с помощью 48-битного полноцветного оптического сканера. После приготовления суспензии дрожжей TZero в фазе запаздывания подвергните их воздействию зеленого света 4,38 джоулей на квадратный сантиметр в присутствии 0,2% бенгальской розы.
Обозначают сохранившиеся грибы как Т-1. Подвергните выжившие грибы той же дозе ФДТ. Миниатюрные мутанты C-Glabrata демонстрировали более медленный рост по сравнению с необработанными родительскими грибами обычного размера.
Однократное лечение антимикробной фотодинамической терапией значительно ингибировало рост C-Glabrata на три раза по сравнению с контролем. C-Glabrata через 24 часа после лечения антимикробной фотодинамической терапией показала бимодальное распределение колоний по размерам с большими и маленькими миниатюрными колониями. Миниатюрные колонии, которые поддерживали белый цвет, демонстрировали митохондриальную дисфункцию, в то время как некоторые меньшие колонии красного цвета и колонии нормального размера сохраняли нормальную митохондриальную функцию.
