После выращивания афлатоксигенного Aspergillus flavus NRRL 3357 на картофеле с наклоном декстрозы в течение шести дней при температуре 30 градусов Цельсия, выведите споры грибка из пробирки с 10 миллилитрами воды, содержащей Tween 20. Закрутите пробирку в течение 20 секунд. Взвесь спор гриба профильтровать через стекловату, помещенную в воронку, и использовать для разбавления вихревой фильтрат.
Разведите 100 микролитров аликвоты фильтрованной суспензии с 9,9 миллилитрами воды. После вортекса подсчитайте споры с помощью гемоцитометра. Используя формулу на экране, рассчитайте объем воды, необходимый для разбавления одного объема исходной суспензии от наклона до 1000 спор на микролитр.
Добавьте к рассчитанному количеству воды один объем исходной суспензии. Далее аккуратно разбейте стручки арахиса и удалите шелуху. Поместите семена в стерильную мензурку.
Добавьте 0,05% раствор перекиси водорода, пока стакан не заполнится на 70%, позволяя семенам впитать воду в течение трех часов. Сцедите раствор перекиси водорода из семян и добавьте примерно в три раза больше 80%-ной смеси этанола, чтобы покрыть семена. Высиживайте в течение одной минуты.
Затем дважды промойте семена равными объемами стерильной дистиллированной воды. Добавьте в стакан пятикратный объем 3%-ного раствора перекиси водорода и дайте ему постоять пять минут. После сцеживания раствора перекиси водорода дважды промойте семена равными объемами стерильной воды.
Поместите в крышку фильтровальную бумагу диаметром 90 миллиметров и смочите бумагу одним миллилитром стерильной воды. Накройте блюдо крышкой. Выложите семена на стерильное бумажное полотенце.
С помощью щипцов удалите кожицу семени. Немедленно поместите очищенные семена в чашку Петри, чтобы избежать обезвоживания. Отрежьте примерно одну треть семени, содержащего зародышевую ось.
Разделите семя на семядоли и с помощью острого сверла просверлите примерно на 1,5-2 миллиметра вглубь середины внешней стороны каждой семядоли. Поместите четыре-шесть просверленных кусочков семян в чашку с 1,5%-ным шнеком. С помощью пипетки объемом 10 микролитров добавьте по два микролитра споровой суспензии в просверленную полость каждой половины семядолейного кусочка.
Накрыв посуду крышкой, выдерживать при температуре 30 градусов Цельсия без света в течение 72 часов.
