Для начала возьмите клетки размером 293 фута, культивируемые в 10-сантиметровой чашке, и аспирируйте среду. Промойте клетки пятью миллилитрами PBS. Затем добавьте один миллилитр трипсина ЭДТА, и инкубируйте 3-5 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы отделить клетки от чашки.
После инкубации добавьте в клетки девять миллилитров полного DMEM, чтобы нейтрализовать трипсин. Многократно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы получить однородную суспензию одиночных клеток, и перенесите клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. Сразу же переложите 20 микролитров клеток в 1,7 миллилитровую трубку, и смешайте с 20 микролитрами трипанового синего морилки.
Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Перенесите соответствующий объем клеток в 50 миллилитровую пробирку, и разведите в полной DMEM. Добавьте по два миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 10% углекислого газа в течение ночи. Перед трансфекцией разбавляют нанолюциферазу CRAF и 1433 дзета-галоплазмиды, а также пустой вектор pCDNA3 в TE-буфере. Наклейте этикетку на набор стерильных туб объемом 1,7 миллилитров.
Добавьте по 100 микролитров трансфекционной среды в каждую пробирку вместе с конструкциями выражения. Теперь добавьте два микролитра реагента для трансфекции, и вихрем аккуратно перемешайте. Pulse кратковременно вращают пробирки в микроцентрифуге, а затем инкубируют пробирки при температуре около 25 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы образовались трансфекционные комплексы.
После этого добавляйте трансфекционные комплексы в клетки по каплям и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16-20 часов для экспрессии ореола и нанотированных белков.
