Для начала наклейте этикетку на три комплекта стерильных 1,7-миллилитровых пробирок и один комплект стерильных 15-миллилитровых пробирок с коническим дном. Подготовьте качающуюся ковшовую центрифугу с 15-миллилитровыми вставками для пробирок и предварительно охладите до четырех градусов Цельсия. Возьмем шестилуночный планшет для культивирования клеток с трансфицированными 293FT-клетками.
Отсасывайте среду из скважин. Добавьте 250 микролитров трипсина-ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов, пока клетки не начнут отделяться. Затем добавьте по одному миллилитру 10%-ной пробирной среды, дополненной FBS, в каждую лунку и энергично пипетируйте, чтобы создать одноклеточную суспензию.
Перелейте один миллилитр клеточной суспензии в заранее размеченные 15-миллилитровые пробирки. Добавьте по одному миллилитру 10% пробирной среды, дополненной FBS, в каждую из этих пробирок и переверните пять раз для перемешивания. Затем сразу же переложите 20 микролитров клеточной суспензии в пробирку с одним набором.
Теперь центрифугируйте пробирки объемом 15 миллилитров в течение пяти минут при плотности 250 г в предварительно охлажденной центрифуге. Смешайте 20 микролитров трипанового красителя для голубых клеток с клетками в первом наборе и подсчитайте с помощью счетчика клеток или гемоцитометра. После извлечения 15-миллилитровых пробирок из центрифуги аспирируйте среду из клеточных гранул и ресуспендируйте гранулы в бессывороточных средах для анализа для создания одноклеточной суспензии.
Для рефляции клеток в 384-луночных и шестилуночных планшетах несколько раз переверните 15-миллилитровые пробирки для получения однородной клеточной суспензии и перенесите 500 микролитров в 1,7-луночные пробирки во втором и третьем наборах. Добавьте 0,5 микролитра ДМСО на второй набор и 0,5 микролитра лиганда Halo 618 на третий набор пробирок и хорошо перемешайте. Перенос суспензий ДМСО и лиганд-положительных ячеек в отдельные лунки резервуаров с реагентами.
С помощью многоканальной пипетки переведите 40 микролитров каждой суспензии на 384-луночный планшет для культивирования. Перенесите оставшиеся клетки в свежие шестилуночные культуральные планшеты для последующего вестерн-блоттинга и инкубируйте 384-луночные и шестилуночные планшеты в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Принимайте бессывороточные пробирные среды, предварительно подогретые до 37 градусов Цельсия.
Разбавьте размороженный субстрат нанолюциферазы в соотношении 1:100 в бессывороточной среде для анализа и перенесите его в резервуар с реагентами. С помощью многоканальной пипетки перенесите по 10 микролитров субстратной смеси в каждую лунку 384-луночного планшета для культивирования. Аккуратно поворачивайте тарелку в течение одной минуты.
Вставьте 384-луночный планшет в многорежимный считыватель планшетов и зарегистрируйте излучения 460 и 618 нанометров из всех скважин с ячейками. Рассчитайте исходные соотношения BRET для носителя-положительного и лиганд-положительного в единицах milliBRET с использованием заданного уравнения. Рассчитайте скорректированное отношение BRET путем вычитания положительного отношения BRET к носителю из положительного лиганда.
Нано-CRAFS259A мутант снижает сигнал BRET примерно на 45%, а нано-CRAFS621A мутант примерно на 25%.
