Для начала подготовьте интерфейс белкового пептида для диверсификации последовательностей. Откройте PDB-файл в химере и убедитесь, что структура целевых субъединиц не повреждена и не содержит отсутствующих атомов или связей. Чтобы удалить все заменимые молекулы из структуры, нажмите «Выбрать», затем «Остаток», а затем выбрать все молекулы, кроме стандартных аминокислот.
Затем нажмите на Действия, а затем на Атомы/Связи и удалите. Затем нажмите на «Избранное» и «Последовательность», а затем нажмите на цепочку, которая считается лигандом. Обрезайте цепь лиганда до идентифицированного взаимодействующего сегмента, удалив все остатки, кроме тех, которые находятся между выбранными позициями.
Нажмите «Файл» и сохраните PDB, чтобы сохранить отредактированную структуру в другом PDB-файле. Скопируйте этот файл в папку Linux, доступную для приложений Rosetta. Используйте фиксированное PDB-приложение Rosetta для выполнения повторной упаковки всех аминокислотных боковых цепей базовой структуры перед диверсификацией последовательности, выполнив эту команду.
Затем переименуйте переупакованный PDB-файл с суффиксом подчеркивания repack с помощью следующей команды. Затем запустите pepspec в режиме проектирования, чтобы выполнить диверсификацию последовательностей с помощью этой команды. Затем сгенерируйте шим с помощью gen_pepspec_pwm.
py, включенный в состав Rosetta Suite. Чтобы запустить этот скрипт, используйте следующую команду. Чтобы создать логотип последовательности, откройте файл с пептидными последовательностями, сгенерированными на предыдущем шаге, в предпочитаемом текстовом редакторе и скопируйте все последовательности.
Перейдите на веб-сервер логотипов и вставьте последовательности в текстовое поле выравнивания нескольких последовательностей. Выберите желаемый формат и размер логотипа в соответствии с длиной ввода и нажмите на кнопку «Создать логотип». Используя этот протокол, были предсказаны предпочтения аминокислот для консервативного мотива pLxIS на поверхности связывания IRF5.
Положение, весовая матрица и логотип последовательности, полученные при диверсификации последовательностей, показали предпочтение глутамата в положении 432 и лейцина и изолейцина в положениях 433 и 435. Позиции 427, 429 и 436, обычно занимаемые серином, показали более высокое предпочтение аспартата и глутамата, что подчеркивает роль фосфорилирования и димеризации IRF5. Позиция 425 показала высокое предпочтение серина, что предполагает его участие в белок-белковом взаимодействии в его нефосфорилированной форме.
