Для начала поместите все материалы, необходимые для культивирования клеток HEK 293, в чистый колпак биобезопасности. После размораживания переносят суспензию ячейки HEK 293 из флакона в предварительно подогретую суспензию суспензионной среды в 50-миллилитровую пробирку. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия при влажности 80%, углекислом газе 8% и 200 оборотах в минуту в течение трех-четырех дней.
Добавьте 100 микролитров клеточной суспензии к 400 микролитрам 0,4%-ного раствора трипанового синего и осторожно переверните пробирку, чтобы перемешать. Поместите 50 микролитров клеточной суспензии, обработанной Trypan Blue, на предметное стекло гемоцитометра, подсчитайте общее количество жизнеспособных клеток и рассчитайте необходимое количество клеточной суспензии для трансфекции. Добавьте необходимое количество клеточной суспензии в предварительно нагретую суспензию ячеистую среду и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 8%-ным углекислым газом.
Добавьте 1 миллион клеток на миллилитр клеточной суспензии HEK 293 в 300 миллилитров суспензионной клеточной среды и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 8% углекислого газа. На вторые сутки подогрейте клеточную среду суспензии, плазмиды и реагент для трансфекции до комнатной температуры. Добавьте плазмиды в подготовленную среду и ненадолго перемешайте, затем добавьте реагент для трансфекции и снова ненадолго перемешайте, прежде чем инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
Во время инкубации смеси для трансфекции подсчитайте количество клеток, культивируемых в первый день, и при необходимости отрегулируйте плотность клеток в диапазоне от двух до 2,5 миллионов клеток на миллилитр. Через 30 минут по каплям добавьте смесь для трансфекции в клетки, осторожно вкручивая пробирку, и инкубируйте от 72 до 96 часов. На пятый день добавьте к клеткам 33 миллилитра 10-кратного буфера лизиса клеток и перемешайте путем легкого встряхивания.
Выдерживают суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов при встряхивании. Центрифугируют клеточную суспензию при температуре 3,428 G при четырех градусах Цельсия в течение 60 минут. Отфильтруйте надосадочную жидкость через вакуумный фильтр PES толщиной 0,45 микрона и соберите осветленный лизат в контейнере фильтра.
Добавьте 90 миллилитров 40%-ного раствора ПЭГ 8 000 к 360 миллилитрам отфильтрованного клеточного лизата. Добавьте 70%-ный стерилизованный этанолом стерилизатор к лизату клетки и перемешайте при 300 об/мин на льду или в холодном помещении в течение одного часа, затем инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия без перемешивания.
