Для начала перенесите всю осажденную ПЭГ культуру аденоассоциированного вируса HEK293 в большую коническую пробирку. Центрифугируют культуру при 2, 820 г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 15 миллилитрах PBS с кальцием и магнием.
Переложите ресуспендированную часть в 50-миллилитровую пробирку. Добавьте 10 миллилитров PBS, чтобы собрать оставшийся осадок ПЭГ, и перелейте все в 50-миллилитровую пробирку. Затем добавьте 40 микролитров ДНКазы I и инкубируйте в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.
С помощью стеклянной пипетки Пастера наполните полиалломерную пробирку размером 25 на 89 миллиметров 15,5 миллилитрами концентрированного клеточного лизата. Используя новую стеклянную пипетку Пастера, осторожно влейте девять миллилитров 15%-ного раствора йодиксанола под лизат клетки. Затем добавьте по пять миллилитров 25%-го и 40%-го растворов йодиксанола.
И, наконец, добавьте пять миллилитров 60%-ного раствора йодиксанола. Используйте шприц, чтобы наполнить пробирку PBS, чтобы убедиться, что большинство пузырьков воздуха удалено, не нарушая слои йодиксанола. Запечатайте трубку с помощью электрического топпера.
Убедитесь, что различные слои градиента йодиксанола хорошо видны. Центрифугируйте пробирки с помощью неповоротного ротора при давлении 490 000 г в течение одного часа и 10 минут при температуре 16 градусов Цельсия. После центрифугирования соберите пробирки в металлическую застежку.
Приложите к шприцу иглу 19 калибра. Затем создайте прокол в верхней части трубки с помощью иглы 30-го калибра, оставив иглу вставленной. Осторожно проколите пробирку чуть ниже границы 40%60%йодиксанола, на что указывает индикатор фенолового красного.
Убедитесь, что скос иглы обращен к 40%-ному слою. Извлеките иглу 30-го калибра недоминантной рукой, медленно извлекая смесь вируса и йодиксанола. Примерно на полпути поверните иглу так, чтобы скос был направлен вниз, и продолжайте экстракцию, избегая скопления из белкового слоя.
После экстракции немедленно перенесите пробирку ультрацентрифуги в пробирку объемом 50 миллилитров, чтобы утилизировать ее. В 15-миллилитровую пробирку добавьте собранную суспензию AAV-йодиксанола, и разведите ее в пять раз в PBS, заполнив до 15 миллилитров. Переложите суспензию в центробежную фильтрующую трубку и центрифугу при 3,428 г на 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.
После отбрасывания проточной жидкости добавьте в фильтрат 15 миллилитров 5%-ной сахарозы PBS и ресуспендируйте ее. Соберите концентрированный AAV из трубки центробежного фильтра. Наконец, храните вирус аликвоту при температуре 4 градуса Цельсия до трех месяцев.
