Для начала поместите аликвоту липосом на водяную баню при комнатной температуре, чтобы оттаять пузырьки. Предварительно уравновесьте экструдер, оснащенный фильтром с буфером А. Затем пропустите размороженные липосомы в экструдер 13 раз. Соберите выдавленные липосомы в пластиковую трубку, минимизировав мертвый объем.
Далее пипеткой нанесите один миллилитр разведенного раствора липосомы в прозрачную кювету. Измерьте его начальную оптическую плотность на 540 нанометрах с помощью спектрофотометра. Добавьте 50 микролитров 10% Triton X-100 в липосомы.
Когда раствор достигнет максимальной оптической плотности, титруйте его против Triton X-100 до тех пор, пока не будет получена оптическая плотность 60% насыщения. Вылейте дестабилизированные моющим средством пузырьки обратно в пластиковую трубку. Далее добавьте очищенный мембранный белок к дестабилизированным липосомам до тех пор, пока не будет получено желаемое соотношение 400 к 1.
Нагрейте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут. Затем добавьте 200 миллиграммов смачиваемого полистирольного бисера, чтобы удалить моющее средство. Теперь закрепите пустую 10-миллилитровую колонну самотечного потока над пустой 6,5-миллилитровой ультрацентрификационной трубкой, помещенной на лед.
Вылейте образец в колонну гравитационного потока и соберите протеолипосомы в ультрацентрифугирующую трубку. Добавьте в бусины 0,5 миллилитра буфера А. Соберите фильтрат в ультрацентрифужную пробирку.
Затем поместите липосомы в ультрацентрифугу для ее концентрации. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендировать гранулированные протеолипосомы в общем объеме 200 мкл буфера А. Разделить конечный объем протеолипосом на три аликвоты. Небольшое количество Triton X-100 первоначально привело к увеличению поглощения на 540 нанометров.
Дальнейшее добавление приводило к частичной солюбилизации везикул. В нашем Rsol липосомы были полностью растворены.
