Для начала включите шкаф с ламинарным потоком воздуха, дав ему стабилизироваться в течение трех минут. Асептически очистите и продезинфицируйте внутренние поверхности шкафа с помощью следующих дезинфицирующих средств. После дезинфекции любого материала, который попадет в шкаф, поместите в шкаф салфетки и нитриловые перчатки.
Затем выключите шкаф и подвергните его воздействию ультрафиолета в течение 15 минут. После облучения снова запустите шкаф. Поместите реагенты для дизайна грунтовки в холодильник, наполненный льдом.
Продезинфицировав его с помощью 70% этанола, поместите контейнер внутрь шкафа. Приготовьте петлевую изотермическую амплификацию, или смесь LAMP, в микроцентрифужной пробирке объемом 0,6 миллилитров. Пипеткой измельчите смесь, чтобы она была гомогенизирована.
Далее инкубируйте закрытые трубки в нагревательном блоке при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем охладите трубки в охладителе из полистирола со льдом в течение пяти минут. После остывания поместите трубки в ламинарный шкаф.
Чтобы завершить смесь LAMP, добавьте четыре микролитра ДНК-полимеразы, а затем один микролитр обратной транскриптазы. Чтобы выполнить колориметрическое обнаружение, добавьте дигидроксинафтол синий. После добавления реагента пипеткой в каждый раствор правильно перемешайте реагенты LAMP.
Далее пипеткой нанесите 22 микролитра раствора в ПЦР-пробирки, стараясь не создать пузырьков. Для отрицательного контроля добавьте три микролитра 0,1% диэтилпирокарбоната воды. Отложите в сторону все оставшиеся пробирки для добавления генетического материала.
Далее уберите все материалы из шкафа. После дезинфекции поверхностей шкафа 70% этанолом выключите его. В отдельной области добавьте три микролитра образца в каждую ПЦР-пробирку и хорошо проведите пипетку микропипеткой объемом 20 микролитров для полной гомогенизации.
Прежде чем начать колориметрическую реакцию, используйте высококачественную камеру, чтобы сделать снимки ПЦР-пробирок. Теперь проведите реакцию с помощью термоамплификатора и водяной бани. Для термоамплификатора поместите трубки в реакционный блок и установите термопрофиль на оборудовании.
Если вы используете водяную баню, надежно поместите трубки в круглые емкости, затем поместите эти емкости на водяную баню при температуре 66,3 градуса Цельсия на 60 минут. По истечении времени реакции извлеките пробирки и храните их при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Если проводилась колориметрическая реакция, сделайте снимки ПЦР с помощью высококачественной камеры.
Температурный градиент показал, что оптимальная температура плавления составляет 66,3 градуса Цельсия. Концентрация фермента BST 3.0 была оптимизирована до 3,2 международных единиц на микролитр. Для определения колориметрической стратегии оценивали фенольный красный в нейтральных красителях.
Однако после амплификации изменения цвета не наблюдалось. Стандартизацию различных концентраций гидроксинафтола синего проводили с оптимальным изменением, происходящим при 125 мкм гидроксинафтола синего. Амплифицированные образцы продемонстрировали изменение цвета в соответствии с их концентрацией.
Амплификация образца была дополнительно подтверждена с помощью электрофореза.
