Для начала поместите усыпленную мышь лежа на доске для вскрытия. С помощью рассекационных Т-образных штифтов закрепите подушечки лапок мыши к доске. Хирургическими ножницами для вскрытия разрежьте нижнюю часть живота и разрежьте до подбородка.
Отделив кожу от брюшинной оболочки, натяните ее перпендикулярно в сторону от туловища и приколите вниз. С помощью тупых щипцов осторожно удалите шейные, аксиальные, плечевые и паховые лимфатические узлы, а также селезенку и поместите их в клеточное ситечко толщиной 70 микрометров, содержащее два миллилитра среды R9. Чтобы приготовить суспензию для одиночных клеток, поверните инструмент для разрушения тканей на пол-оборота по часовой стрелке и против часовой стрелки несколько раз.
Промойте ситечко пятью миллилитрами среды. Затем переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте ее. После сцеживания надосадочной жидкости добавьте в пробирку 500 микролитров лизирующего буфера для удаления эритроцитов.
Через одну минуту смешайте клетки с 9,5 миллилитрами среды R9. Центрифугируйте пробирку. И тщательно сцедите надосадочную жидкость.
Затем ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах отрицательной селекционной среды, содержащей антитела против MHC2 и CD4, и поместите пробирку в коромысло на 30 минут. После гранулирования клеток при 270G в течение пяти минут сцедите надосадочную жидкость. Одновременно в конической трубке объемом 15 миллилитров промыть 200 микролитров овечьих противокрысиных и иммуноглобулиновых бусин G в семи миллилитрах среды.
Поместите трубку на магнит и извлеките среду. Промыв еще два раза, снова суспензируйте бусины в семи миллилитрах среды R9. Затем смешайте семь миллилитров суспензии шариков с клеточной гранулой и инкубируйте трубку на коромысле.
Чтобы удалить клетки, связанные с шариками антител, поместите коническую трубку непосредственно на магнит на три минуты. Аспирируйте клеточную суспензию в новую 15-миллилитровую трубку, удерживая трубку на магните. Гранулируйте обогащенные CD8-положительными клетками и промойте три раза в среде.
