Для начала выполните покадровую визуализацию живых Т-лимфоцитов, выделенных из вторичных лимфоидных тканей мышей. Для анализа миграции Т-клеток откройте программное обеспечение Velocity и создайте новую последовательность изображений. Выберите и переместите видеоролики с покадровой видеомикроскопией за все время в синюю область в Velocity.
Используя инструмент повышения контрастности, измените яркость и контрастность, затем отрегулируйте размеры изображения до 0,325 микрометра для 20-кратного увеличения и 0,65 микрометра для 10-кратного увеличения. После настройки последовательности для установки временных точек перейдите на вкладку измерения и снимите все временные точки. Затем найдите объекты с помощью интенсивности и сдвиньте полосу вправо от пика.
Чтобы избежать клеточного мусора, исключите все клетки размером менее 10 микрометров и диаметром более 100 микрометров. Отметьте галочкой игнорирование статических объектов с последующим автоматическим соединением битых дорожек. Чтобы сохранить новый протокол, перейдите в раздел измерения.
Нажмите кнопку Сохранить протокол, а затем введите название нового протокола. Во вкладке измерений нажмите на «Измерить все временные точки» и отсортируйте треки по временному интервалу от высокого до минимального. После записи идентификационных номеров дорожек для ячеек с хорошими дорожками экспортируйте файл в виде текста, разделенного запятыми, и передайте данные в нужное программное обеспечение для анализа.
Чтобы выполнить ручное отслеживание, откройте изображение J, перейдите в плагины и выберите отслеживание и ручное отслеживание. Установите временные интервалы X для калибровки по Y, размера пикселя и калибровки по Z. Затем нажмите на кнопку «Добавить дорожку», чтобы начать отслеживание отдельных ячеек.
Выберите одну ячейку в первой временной точке и продолжайте ее по всем временным точкам. Наконец, нажмите на конечную дорожку. Программное отслеживание клеток, характеризующее миграционное поведение активированных отдельных Т-клеток, обозначенное линиями разного цвета.
