Для начала поместите биочипы модели BC002 в стеклянную чашку Петри и промойте все полости стерильным 70%-ным этанолом в течение 45 минут. Затем дважды промойте полости стерильной двойной дистиллированной водой. С помощью пипетки объемом 1 000 микролитров с синими наконечниками покройте мембрану биочипа верхней полости стерильным раствором Collagen IV.
Инкубируйте чип в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После инкубации дважды промойте нижнюю и верхнюю камеры стерильным ПБС, содержащим магний и кальций. Верхнюю камеру каждой полости заполните 250 микролитрами эндотелиальных клеток или ЕС-среды, содержащей пенициллин стрептомицин, а нижнюю камеру – 150 микролитрами.
Промойте сливающуюся культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека в колбе Т25 пятью миллилитрами DPBS без магния и кальция PBS. Добавьте один миллилитр 0,25 трипсина и один миллимоляр ЭДТА в PBS. И выдерживать в течение трех минут при температуре 37 градусов по Цельсию.
После инкубации добавьте пять миллилитров PBS и 5% FCS, чтобы остановить активность трипсина. В конической пробирке объемом 50 миллилитров центрифугируйте суспензию при 350G в течение пяти минут. И повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре EC среды.
Добавьте 10 микролитров разбавленной клеточной суспензии от одного до 10 в микроцентрифужную пробирку, содержащую 10 микролитров трипанового синего красителя. Подсчитайте ячейки вручную с помощью камеры Нейбауэра. После подсчета замените среду эндотелиальных клеток в верхней камере биочипа на 200 мкл среды ЕС, содержащей 0,4 умножить на 10 в степени культуры эндотелиальных клеток шести пупочных вен человека.
Поместите стеклянную чашку Петри с биочипами при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Выполняйте ежедневную замену среды с 300 микролитрами EC-среды для верхней камеры и 200 микролитрами RPMI+medium для нижней камеры. После промывки моноцитов одним миллилитром PBS инкубируйте их в предварительно подогретом PBS, содержащем лидокаин и ЭДТА, при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в течение семи минут.
Соберите и центрифугируйте клетки при температуре 350G в течение семи минут. После повторного суспендирования в одном миллилитре RPMI+подсчет клеток, как показано ранее. Семена 0,1 умножить на 10 в степени шести моноцитов, взвешенных в 200 мкм РПМИ+ в нижней камере.
Поместите порты биочипа вниз, чтобы клетки прикрепились к мембране.
