Перед подключением стерилизованной трубки к биочипу сначала промойте трубку 200 микролитрами PBS, а затем 200 микролитрами EC-среды. Промыв верхнюю и нижнюю камеру свежеприготовленной средой для клеточных культур, вставьте резервуар на выходной стороне биочипа и соедините резервуар с трубкой с входным отверстием биочипа. Для получения циркулярной среды подсоедините трубку к резервуару и биочипу.
Теперь наполните резервуар 500 микролитрами ЕС-среды. Соедините биочип с трубкой, чтобы начать растушевку со скоростью потока 21 микролитр в минуту. На следующий день прекратите обильность и опорожните водоемы.
Под стерильным защитным шкафом нанесите пипеткой 500 микролитров среды EC в резервуары и аккуратно промойте нижнюю камеру 200 микролитрами RPMI plus medium. Затем возобновите перфузию со скоростью потока 21 микролитр в минуту. Чтобы установить воздушно-жидкостную границу раздела с 12-го по 14-й день, откройте заглушки в нижней камере и осторожно впитайте среду до тех пор, пока не станет виден пузырь воздуха.
Убедившись, что вся жидкость из канала и камеры удалена, осторожно закройте порты, заполните резервуар свежеприготовленной сосудистой средой EC и продолжайте обильный посев только в верхней камере до 14-го дня. Отсоедините биочипы от проточной системы. После удаления трубки исследуйте клеточные слои биочипа под микроскопом на предмет слияния клеток.
Промойте полости биочипов PBS, чтобы удалить питательную среду для клеток. Добавьте 300 микролитров 4%-ного раствора параформальдегида в PBS в верхнюю камеру и 200 микролитров в нижнюю камеру. После 10 минут инкубации трижды промыть камеру ПБС.
Для пермеабляции добавьте 300 микролитров 0,25% Triton X 100 в PBS и инкубируйте в течение 30 минут, после промывки PBS пипеткой 300 микролитров 3% бычьего сывороточного альбумина в PBS в обеих камерах и инкубируйте в течение одного часа. Для иммунофлуоресцентного окрашивания готовят 50 микролитров растворов антител с использованием 3% БСА для каждой мембраны с использованием соответствующих соотношений разведения. Чтобы получить доступ к клеткам внутри биочипа, сделайте точный разрез снаружи полости и снимите связующую фольгу.
С помощью скальпеля вырежьте мембрану, удалив края, запаянные к биочипу. Разделив мембрану на две части, соберите кусочки мембраны пинцетом и поместите их на микроскопическое предметное стекло для окрашивания, добавьте на каждый кусочек мембраны 50 микролитров раствора антител и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия, защищая от света. После трижды промывки мембраны PBS добавьте каплю монтажного средства на маркированное предметное стекло и установите соответствующую мембрану.
Добавьте каплю монтажного материала на верхнюю часть мембраны и установите покровное стекло. Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток пупочной вены человека выявило морфологические изменения и экспрессию маркопротеинов после 14 дней совместного культивирования. Со стороны сосудов когерентная экспрессия V на границах эндотелиальных клеток свидетельствовала о слиянии и образовании эндотелиального барьера.
Эпителиальная сторона оценивалась на экспрессию экахеррина и сурфактантного белка А, что указывает на целостность и функцию альвеолярного эпителия.
