Начните с проведения анализа MM QPCR для измерения длины теломер. Затем откройте программное обеспечение и выберите функцию настройки пластины. После этого выберите вариант просмотра или редактирования тарелки из выпадающего меню.
Теперь выделите все лунки на тарелке. Нажмите выбрать флорафоры. Отметьте галочкой поле с надписью «кибер» и убедитесь, что все остальные поля сняты.
Затем нажмите OK для подтверждения. Сохраняя выделение на всех скважинах, найдите и установите флажок рядом с надписью «кибер», рядом со словом «нагрузка», чтобы пометить все скважины с помощью «кибер». Теперь выделите три контрольные лунки, не относящиеся к шаблону, расположенные вверху или внизу стандартного контрольного серийного разведения.
Затем в меню типа образца справа выберите NTC. Выделите 21 лунку, составляющую стандартную контрольную последовательную разведку, и выберите стандартную в меню типа пробы. Пока эти скважины еще выбраны, нажмите на техническую репликацию, в меню размера репликации выберите три.
Затем выберите горизонтальное положение и нажмите «Применить». После этого прокрутите вниз до раздела серий разбавления и введите два в поле коэффициента разведения. Для пластины P1 введите два умножить на 10 в степень отрицательной тройки в поле начальной концентрации.
Затем выберите поле для уменьшения и нажмите «Применить», чтобы подтвердить настройки. Для пластины P2 введите 3,13 умножить на 10 в степень минус пять в поле начальной концентрации. Убедитесь, что установлен флажок для увеличения, а затем нажмите кнопку Применить, чтобы завершить настройку.
Теперь выделите столбцы, соответствующие ПЦР-полоске А, в меню типа образца, выберите неизвестный, затем перейдите к выбору технической репликации. В меню репликации размера выберите три и выберите горизонтальный, прежде чем нажать «Применить». Нажмите OK в правом нижнем углу окна редактора пластин.
Подтвердите изменения, нажав «Да» при появлении запроса. Затем убедитесь, что кривые на вкладке количественного определения подходят как для девятого, так и для второго этапа, и что значения эффективности между этими двумя шагами не расходятся более чем на 10%.Для P1 выберите девятый шаг и выделите 21 скважину, соответствующую стандартной кривой. Скопируйте значения CQ из правого нижнего угла окна программы.
Затем откройте шаблон таблицы данных Telomere и вставьте эти значения в стандартный столбец B. После этого введите значение наклона шага девять в ячейку C четыре на стандартном листе One, убедитесь, что коэффициент изменения для каждого стандартного трехкратного разбавления ниже 0,1. На CFX исключите из анализа любые выбросы данных, из-за которых набор тройных чисел выходит за пределы диапазона. Теперь убедитесь, что только 72 пробные лунки в файле анализа P1 выделены синим цветом на вкладке количественной оценки.
Затем на девятом шаге скопируйте значения CQ и SQ, найденные в правом нижнем углу окна программного обеспечения, и вставьте их на лист образцов P1, начиная с ячейки D3. Используя CFX maestro, убедитесь, что все значения CQ для аналитических образцов находятся в диапазоне от самых низких и максимальных значений CQ стандартной кривой. На листе Excel убедитесь, что начальная концентрация в NTC составляет менее 5% от среднего количества ДНК в лунках образца. Для контроля качества на уровне образца следует изучить стандартные отклонения и коэффициент вариаций в столбцах J и K на листах образцов Р1 и Р2.
Убедитесь, что количество баллов между образцами в листе Р1 и Р2, в частности в столбце G, не превышает 0,05. Если межпластинчатое CV образца превышает допустимое, исключите из расчета до одного трипликата для каждого образца. Для контроля качества на уровне пластин убедитесь, что среднее изменение между пластинами по всем образцам на каждой пластине меньше 0,05.
Если межпластинчатое CV образца превышает допустимое, исключите из расчета до одного трипликата для каждого образца. Для дополнительного контроля качества на уровне пластин убедитесь, что общая разница между пластинами на листе P1 и P2 составляет менее 0,06.
