Выделение и срез поясничного отдела спинного мозга мыши для получения органотипических срезов для тестов регенеративной терапии

Для начала получите поясничный отдел позвоночника щенка в чашке, содержащей среду для холодной диссекции. С помощью диссекционного стереомикроскопа и микроножниц разрежьте позвоночник по сагиттальной оси. Прямым пинцетом аккуратно извлеките спинной мозг из позвоночной полости и осторожно снимите мозговые оболочки с изолированной поясничной области спинного мозга, или СК. Перенесите и инкубируйте изолированную область поясничного отдела СК в холодной и свежей среде для рассечения в течение 10-15 минут.

С помощью пластиковой пастеровской пипетки поместите салфетку на режущую деку измельчителя перпендикулярно лезвию. После удаления остаточной среды для рассечения приступайте к автоматизированному разделу СК. С помощью пастеровской пипетки переложите ломтики и инкубируйте их со свежей средой для рассечения в 35-миллиметровой посуде в течение 15 минут. Промойте поверхность мембранной вставки для культивирования три раза органотипической средой (ОМ) и оставьте один миллилитр среды на дне мембранной вставки.

Рассмотрите срезы под диссекционным стереомикроскопом и засейте нужное количество срезов на кондиционированных мембранных вставках. Отрегулировав ориентацию ломтиков и удалив лишнюю среду, инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем переложите вкладыш в новую чашку Петри и добавьте один миллилитр свежего ОМ с добавлением GDNF на дно мембранной вставки.

Инкубируйте ломтики при температуре 37 градусов Цельсия. В первый день ex vivo замените старую среду на свежую ОМ. На третий день перейдите на привитую среду с добавлением GDNF и добавляйте свежую GDNF в среду каждый день до седьмого дня ex vivo. Для остальной части долгосрочного культивирования добавляйте GDNF только при смене среды.

Иммунофлуоресцентный анализ органотипических срезов мышей с длительным культивированием СК выявил широкое распределение нейрофиламента цитоскелетного маркера и маркера ядерных нейронов RBFOX3, что свидетельствует об их здоровом состоянии и нейронной идентичности.