Иммунофлуоресцентное окрашивание органотипических срезов с трансплантатами стволовых клеток для конфокальной микроскопии

Для начала необходимо получить мышиные органотипические срезы, трансплантированные с нейроэпителиальными стволовыми клетками спинного мозга человека, или клетками HSCNES. Удалите среду со дна мембраны вкладыша и трижды промойте ломтики предварительно подогретым PBS или DPBS от Dulbecco. Далее аспирируйте DPBS и замените его 1,5 миллилитрами предварительно подогретого 4%-ного формальдегида.

Затем добавьте один миллилитр 4%-ного формальдегида в верхнюю часть мембраны. После трехкратной промывки DPBS, с помощью хирургического ножа, по окружности разрежьте вставную мембрану и отделите ее вместе с ломтиками от пластиковой составляющей вставки. После иммунофлюоресцентного окрашивания нанесите 200 микролитров монтажного раствора на чистое предметное стекло.

С помощью прямого пинцета аккуратно поднимите и перенесите плавающую мембрану с 35-миллиметровой чашки на крышку. Впоследствии перенесите мембрану на подготовленное стекло предметное стекло. Накройте мембрану на предметном стекле новым покровным стеклом с 100 микролитрами монтажного раствора.

Дайте ему высохнуть в течение ночи под темным химическим колпаком, прежде чем приступать к конфокальной визуализации. Трансплантированные клетки HSCNES в ткани спинного мозга показали стабильную экспрессию GFP в течение 30 дней, что указывает на хорошую выживаемость.