Получение суспензий одиночных клеток из органоидов кишечника человека, дифференцированных в виде 96 луночных монослоев

Для начала приготовьте реагент для ферментативного расщепления клеток и PBS/EDTA для переваривания органоидов кишечника человека. Под светлопольным микроскопом подтвердить рост дифференцированных трехмерных органоидов кишечника человека в виде монослоев. Выбросьте среду для клеточных культур из монослойной культуры и замените ее 100 микролитрами PBS/EDTA.

После удаления PBS/EDTA добавьте по 100 микролитров теплого реагента для ферментативного расщепления клеток в каждую лунку. Поместите планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с 5% углекислым газом и пипеткой пять раз каждые 10 минут в течение 20-30 минут. Каждые 10 минут перекладывайте один-два микролитра клеточной суспензии на предметное стекло, чтобы оценить диссоциацию, наблюдая за процентным соотношением отдельных клеток.

После диссоциации объедините три повторяющиеся лунки для каждого условия в одной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 700 микролитров среды для дифференцировки клеточных культур, содержащей 10 микромолярных ингибиторов ROCK, и аккуратно перемешайте пипеткой. Отфильтруйте весь объем через ситечко с наконечником 70 микрон, собирая проточный поток в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Фильтруйте проточный поток, полученный через сетчатый фильтр 70 микрон, на сетчатом фильтре с наконечником 40 микрон. Добавьте пять микролитров 0,4%Trypan Blue к пяти микролитрам клеточной суспензии и подсчитайте жизнеспособные одиночные клетки. Разбавьте образец питательной средой для клеточных культур, содержащей ингибитор ROCK, до получения 1000 клеток на микролитр.

В общей сложности 9 952 отдельные клетки были выделены из дифференцированных кишечных органоидов кишечника человека, выращенных в 96 луночных планшетах.