Для начала изолируйте и канюлируйте брыжеечные лимфатические сосуды усыпленной крысы. Надавите на лимфатические сосуды в камере прилипания и позвольте им уравновеситься и развить стабильные спонтанные сокращения. Затем инкубируйте лимфатические сосуды с Фура-2-ацетоксиметиловым эфиром и плуроновой кислотой в течение 30 минут в темноте.
После инкубации опорожните весь объем ванны с помощью вакуума отрицательного давления и трижды наполните его физиологическим раствором физиологической соли соответствующей температуры, не содержащим реагентов. Затем инкубируйте лимфатические сосуды в темноте еще 15 минут, чтобы удалить любой избыточный показатель и дать возможность деэтерификации. Перенесите камеру в инвертированный флуоресцентный микроскоп со светодиодной подсветкой, флуоресцентным объективом 20XS, адаптером для автоматического кадрирования и камерой для захвата флуоресценции с частотой 15 Гц.
Подключите микроскоп к компьютеру, оснащенному программным обеспечением для визуализации, чтобы регистрировать флуоресценцию и выполнять обнаружение краев. Активируйте светодиодный источник света и интерфейс люминесцентной системы. Теперь запустите программу IonWizard.
На вкладке Файл выберите опцию Создать. Затем перейдите на вкладку «Сбор» и выберите «Эксперимент». Загрузите нужный экспериментальный шаблон и нажмите OK. Нажмите кнопку «Пуск», расположенную в нижней части экрана, чтобы начать эксперимент.
Затем настройте кривые на экране, чтобы отобразить диаметр сосуда, числитель, сигнал 340, знаменатель, сигнал 380 и соотношение в порядке убывания. Чтобы изменить масштаб оси Y для лучшей визуализации трассировки, перейдите в раздел Трассировки, убедитесь, что флажок Автоматические ограничения снят, и выберите Редактировать пользовательские ограничения. Выберите параметр, который нужно настроить, введите минимальное и максимальное значения для оси, а затем нажмите кнопку OK для подтверждения.
С помощью программного обеспечения для обнаружения краев отрегулируйте освещение таким образом, чтобы стенка лимфатического сосуда выглядела как темные линии. Выберите интересующий регион или окупаемость инвестиций, свободную от жира и мусора, и убедитесь, что этот ROI не меняется. Установите порог таким образом, чтобы кромка стенки сосуда обнаруживалась на протяжении всего цикла сжатия.
После активации фотоумножителя, с помощью светодиодных осветителей чередуются длины волн 340 и 380 нанометров и выдержки 50 миллисекунд для возбуждения Fura-2. Захват спектров излучения на частоте 510 нанометров и частоте 15 Гц по всему полю изображения. Чтобы измерить соотношение сигнал/фон, сначала получите флуоресценцию 340 и 380 с лимфатическим сосудом в центре поля зрения.
Затем переместите поле зрения к краю ванны, чтобы не было сосуда для захвата фона. После этого замените раствор ванны на соответствующий температуре, не содержащий реагентов физиологический раствор соли, чтобы удалить избыток индикатора Fura-2. Запишите исходный флуоресцентный сигнал Fura-2 и спонтанные сокращения в течение примерно 30 минут.
Затем запишите кумулятивную реакцию концентрации нифедипина и получите фоновые измерения для каждой концентрации препарата. В конце каждого эксперимента промывайте лимфатические сосуды соответствующим по температуре, не содержащим кальция физиологическим раствором соли для получения минимального флуоресцентного сигнала Fura-2 и максимального диаметра лимфатических сосудов в отсутствие ионов кальция. Замените раствор ванны соответствующим по температуре физиологическим раствором соли, содержащим 10 миллимолярных ионов кальция и иономицин для получения максимального флуоресцентного сигнала Fura-2 и минимального диаметра лимфатических сосудов в условиях насыщения ионами кальция.
Параметры, включая амплитуду пика кальция, исходный уровень кальция и пик кальция, демонстрировали зависящее от концентрации снижение при постепенном добавлении нифедипина в перфузионную камеру. В то же время сократительные параметры, такие как сжатие, амплитуда и расчетный поток, также демонстрировали ступенчатое снижение. Манхэттенские графики показали индивидуальные реакции лимфатических сосудов на измерения ритмичности, включая интервал, время сокращения и время расслабления.
