Для начала извлеките две пробирки для криоконсервации, содержащие замороженные мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека, на третьем проходе из жидкого азота. Взбалтывайте их на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия до полного оттаивания. Затем продезинфицируйте пробирки, используя 75% спирт.
Поместите продезинфицированные пробирки на ультрачистый стол. С помощью пипетки отсадите клеточную суспензию и перенесите ее в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку в низкоскоростной центрифуге при температуре 250 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
Тем временем приготовьте четыре 10-сантиметровые блюда для культуры и добавьте в каждое блюдо девять миллилитров среды. Отметьте название, тип клетки, поколение и дату эксперимента на каждой чашке. Затем разогрейте их в термостатическом инкубаторе с ячейками при температуре 37 градусов Цельсия.
После окончания пятиминутного центрифугирования продезинфицируйте пробирку центрифуги, прежде чем переместить ее на сверхчистый стол. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость и добавьте четыре миллилитра среды для достижения нужной концентрации клеток. Аккуратно взбалтывайте раствор до тех пор, пока он равномерно не рассеется.
Далее добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую разогретую посуду и встряхните ее, помешивая ее на ровной поверхности крест-накрест. Наблюдайте за клетками при 40-кратном увеличении под оптическим микроскопом, прежде чем помещать чашки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. На второй день понаблюдайте за состоянием клеток под оптическим микроскопом при 40-кратном увеличении, прежде чем приступать к подготовке обменной среды.
После дезинфекции перенесите посуду для культивирования на ультрачистый стол с уровнем биобезопасности 2. Удалите среду из каждой посуды для культуры. Дважды аккуратно промойте блюдо двумя миллилитрами раствора PBS и добавьте по 10 миллилитров среды в каждое блюдо.
Перенесите клетки в инкубатор до тех пор, пока они не будут готовы к сбору надосадочной жидкости.
