Для начала соберите надосадочную жидкость из культуры мезенхимальных стволовых клеток, полученной из жировой ткани человека, как только клетки слились на 80%. Осторожно соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки и переложите ее в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при давлении 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить взвешенные клетки, затем с помощью пипетки соберите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу.
Центрифугируйте надосадочную жидкость при температуре 2000 x g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Соберите полученную надосадочную жидкость с помощью пипетки и отфильтруйте ее через мембрану размером 0,22 микрона, чтобы удалить крупные частицы и клеточный мусор. Подвергнуть фильтрат ультрацентрифугированию при температуре 10 000 x g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем выполните окончательное центрифугирование при 100 000 x g в течение 70 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, не собирая гранулы. Повторно суспендируйте гранулу в PBS перед центрифугированием пробирки при 100 000 x g в течение 70 минут при четырех градусах Цельсия.
Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте полученную гранулу внеклеточных везикул, или ВВ, в одном миллилитре PBS. Наконец, переложите суспензию EV в центрифужную пробирку объемом один миллилитр и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшего анализа. С помощью просвечивающей электронной микроскопии четко выявлена чашеобразная структура ЭВ с двухслойной мембраной.
Анализ отслеживания наночастиц показал, что их распределение по размерам составляет от 50 до 150 нанометров. Вестерн-блоттинг показал, что характерные маркерные белки ВВ экспрессируются плавно.
