Окрашивание, обезвоживание и инфильтрация фиксированных органоидов сетчатки для подготовки образцов ПЭМ

Чтобы начать окрашивание неподвижных органоидов сетчатки, или РО, для просвечивающей электронной микроскопии, используйте пипетку для удаления кислоты осмия, ранее добавленной к органоидам в микроцентрифужной пробирке во время постфиксации. Затем промойте RO 0,01 моляром PBS при pH 7,4 три раза по 10 минут каждый, а затем промойте деионизированной водой три раза по 10 минут каждый. Удалите последнюю деионизированную воду для промывки, замените ее примерно на 150 микролитров ацетата урана и окрашивайте на один-два часа при комнатной температуре.

Затем в вытяжном шкафу извлеките ацетат урана и замените его одним миллилитром 50% ацетона для обезвоживания образцов в течение 10 минут. Затем проведите градиентное обезвоживание с использованием 70% 80% 90% и два раза по 100% ацетона последовательно, каждый раз в течение 10 минут. После градиентного обезвоживания выбросьте остаточный ацетон и добавьте примерно 150 микролитров смеси ацетона и смолы Epon-812.

Поместите трубку в духовку с температурой 37 градусов Цельсия на один час. После удаления предыдущей ацетоново-смоляной смеси замените ее другим составом из ацетона и смоляной смеси Эпон-812. На этот раз инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь.

Наконец, осторожно перенесите органоиды сетчатки в новую пробирку, содержащую примерно 500 микролитров чистой эпоксидной смолы. И инкубируйте при температуре 45 градусов Цельсия в течение одного часа, прежде чем приступить к встраиванию органоидов.