Для начала поместите фильтр 70 микрометров на пятимиллилитровую полипропиленовую трубку. Пипеткой нанесите на нее 500 микролитров среды нервной клетки. Перенесите диссоциированную ткань гиппокампа мыши в трубку через ситечко.
Затем дважды нанесите пипеткой один миллилитр холодной среды нервных клеток на гомогенизатор, чтобы промыть его. Теперь добавьте 500 микролитров ледяного DPBS в гранулу, чтобы повторно суспендировать ее. Доведите объем суспензии до 1,5 миллилитра с помощью DPBS.
Пипеткой внесите в образец 500 микролитров изотонического раствора перколла. Облейте раствор двумя миллилитрами холодного DPBS в центрифуге. Затем отсасывайте верхний слой и миелиновый диск в средней фазе.
Далее добавьте в пробирку четыре миллилитра холодного DPBS, аспирируйте надосадочную жидкость после центрифугирования ее. Затем повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах раствора для окрашивания на пригодность к жизнеспособности. Подайте пипеткой один миллилитр холодного DPBS в образец перед центрифугированием образца при 300 x g в течение пяти минут.
После отсасывания надосадочной жидкости добавьте 100 микролитров красящего раствора CD16, CD32. Ввергните образец в вихрь в течение пяти секунд, затем инкубируйте. После инкубации добавьте в образец один миллилитр буфера FACS и центрифугируйте.
Пипеткой 100 микролитров красителя смешайте в пробирку. Затем инкубируйте образцы в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. Теперь добавьте один миллилитр буфера FACS в образец перед центрифугированием, как и раньше.
Повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах фиксирующего буфера после удаления надосадочной жидкости. Далее добавьте в пробирку два миллилитра буфера для пермеабилизации и снова центрифугируйте. Пипеткой нанесите 100 микролитров красящего раствора vGLUT1 на гранулу.
Затем перемешайте смесь в течение примерно пяти секунд перед инкубацией и центрифугированием. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 250 микролитрах буфера FACS. Наконец, отфильтруйте образцы через фильтр 40 микрометров.
Более высокий флуоресцентный сигнал vGLUT1-PE наблюдался от микроглии гиппокампа по сравнению с контролем изотипа. Более высокий флуоресцентный сигнал vGLUT1-PE был обнаружен в микроглии обонятельной луковицы и более низкий сигнал в мозжечке по сравнению с гиппокампом. Наименьшая интенсивность сигнала была выявлена в макрофагах селезенки.
