Для начала инкубируйте трубку, содержащую диссоциированную ткань гиппокампа мыши, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Переложите суспензию мутных клеток в новую 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Выбросив надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах раствора промывочной смеси.
Затем пропустите образец через 70-микрометровый фильтр в пятимиллилитровую микроцентрифужную пробирку перед повторным центрифугированием. Подвергните образец градиентному центрифугированию по методу Перколла, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах буфера для окрашивания MACS и инкубируйте. Теперь перед центрифугированием нанесите пипеткой один миллилитр буфера MACS в образец.
Затем суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах буфера MACS. Далее промойте колонки положительного отбора магнитного сепаратора тремя миллилитрами буфера MACS. Аккуратно нанесите 500 микролитров клеточной суспензии на колонку.
После трехкратной промывки колонок буфером MACS поместите колонки на конические трубки объемом 15 миллилитров. Добавьте в столбец пять миллилитров буфера MACS. Далее центрифугируйте образцы при 300г в течение 10 минут, затем добавьте в гранулу один миллилитр предварительно подогретого DMEM.
Перелейте 500 микролитров окончательной клеточной суспензии в лунки 24-луночного планшета. Замените по 250 микролитров каждой лунки свежим подогретым ДМЭМ. Затем добавьте три микрограмма синаптосом, меченных красным цветом pHrodo, поверх среды.
Добавьте такой же объем немеченых синаптосом к негативному контролю. После инкубации лунки промыть холодным ДПБС. Теперь нанесите пипеткой по 200 микролитров трипсина-ЭДТА в каждую лунку.
После 35-секундной инкубации внесите пипеткой по одному миллилитру DPBS, содержащего FBS, в каждую лунку. Перенесите клеточную суспензию в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку через ситечко, затем промойте каждую лунку два раза 500 микролитрами ледяного DPBS. Центрифуга собирала образцы по 500г в течение пяти минут.
После этого инкубируйте клетки в 100 микролитрах окрашивающего раствора в течение 10 минут на льду. Далее добавьте CD11b и CD45 в раствор для окрашивания, чтобы получить конечную концентрацию 1 к 100. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут в темноте.
Внесите пипеткой один миллилитр буфера FACS в образец, затем подвергните его окончательному центрифугированию при 300 г в течение 10 минут перед проточным цитометрическим анализом. Положительная флуоресценция ПЭ, сравнимая с той, что получена из синаптосом, при pH 4 наблюдалась в CD11b-положительной и CD45-положительной микроглии.
