Для начала тщательно очистите все участки инкубатора и перистальтическую помпу дезинфицирующим средством, чтобы обеспечить квазистерильную среду. Затем промойте каждую трубку 700 микролитрами PBS с магнием и кальцием, а затем 500 микролитрами C2 или кондиционированной ЕС средой. Используйте трубку с небольшим расстоянием от замка приманки до стопора перистальтического насоса для левой полости и трубку с другой симметрией для правой полости.
После извлечения биочипа с клетками HUVEC и C2BBe1 из инкубатора проведите обмен среды с 350 микролитрами для каждой камеры. Затем переместите заглушки с нижней на верхнюю площадку. Добавьте 350 микролитров свежей среды в нижнюю камеру биочипа.
После этого снимите все заглушки и заполните все порты до самого верха. Начиная с левой полости, вставьте адаптер замка приманки в порт биочипа, чтобы подсоединить первую трубку к правому порту верхней камеры. Затем подсоедините вторую трубку к левому порту нижней камеры.
Далее возьмите резервуар и добавьте на дно резервуара небольшую каплю клеточной питательной среды. Затем вставьте резервуар на противоположную сторону от первой трубки и повторите для другой камеры. После того, как все порты будут подключены к трубке или резервуару, заполните резервуары 3,5 миллилитрами среды для клеточных культур.
Затем поместите свободную сторону трубки, к которой прикреплена крышка, на верхнюю часть резервуара, чтобы закрыть микрофлюидную систему каждой камеры. Транспортируйте биочип к перистальтическому насосу. С помощью стопоров перистальтического насоса подсоедините каждую трубку к перистальтическому насосу так, чтобы среда поступала из резервуара в полость и обратно через насос.
Затем перфузируйте каждую камеру с расходом 50 микролитров в минуту. Как только предварительное излияние будет завершено, остановите перистальтический насос. Снимите крышку, соединенную с трубкой каждого резервуара, и поместите ее на стерильную салфетку рядом с насосом.
Удалив всю среду, наполните резервуары 2 миллилитрами свежеприготовленной среды. Подсоедините трубку и крышку и продолжайте круговую перфузию со скоростью потока 50 микролитров в минуту в течение еще 24 часов. Как только перистальтический насос будет остановлен, откройте резервуары всех полостей.
Опорожните резервуары и отсоедините трубки и резервуары от биочипа. Промойте микрофлюидные полости 500 микролитрами холодного PBS с магнием и кальцием дважды на камеру. Добавьте 500 микролитров ледяного метанола во все полости.
После вскрытия чипа разрежьте или снимите склеивающую фольгу биочипа. Разрежьте ткань, содержащую ПЭТ-мембрану, пополам для окрашивания параллельно с различными иммунопанелями. С помощью прецизионного пинцета перенесите каждый кусочек мембраны в отдельную лунку в 24-луночный планшет с блокирующим и проникающим раствором.
Затем переложите кусочки мембраны на чистое предметное стекло внутри влажной камеры. Добавьте по 50 микролитров приготовленного первичного антитела и окрашивающего раствора на каждый кусочек мембраны. После того, как образцы будут перенесены в 24-луночный планшет, дважды промойте мембраны в течение 5 минут промывочным раствором, затем PBS, содержащим магний и кальций.
Используя флуоресцентную монтажную среду и покровное стекло, закрепите детали мембраны на чистом предметном стекле и храните их при температуре 4 градуса Цельсия до получения микроскопической визуализации. После пяти дней изобилия ядерная ДНК, окрашенная DAPI, показала полностью дифференцированные моноцитарные макрофаги, экспрессирующие CD68, распространяющиеся по всей сосудистой ткани. HUVEC создают сливающийся слой, демонстрирующий целостность тканей за счет формирования адгезионных соединений, таких как VE-кадгерин.
Кроме того, фактор фон Виллебранда высоко выражен HUVEC. После пяти дней изобилия клетки C2BBe1 образовали поляризованные эпителиальные клеточные слои, экспрессирующие соединительные белки E-кадгерин и ZO-1. Трехмерный рост ворсинчатых и криптоподобных структур эпителия может быть обнаружен в сечениях x и y Z-стека после шести дней перфузии.
