Микроинъекция эмбрионов дрозофилы для трансгенеза эмбрионов, опосредованный интегразой phiC31

Для начала с помощью кисти перенесите дехлорированные эмбрионы дрозофилы на длинную полоску виноградного агара. С помощью иглы для пресечения выровняйте около 60 эмбрионов по краю полоски так, чтобы их задние части были обращены наружу. Теперь поместите двусторонний скотч длиной 18 миллиметров вдоль края покровного скотча.

После снятия подложки аккуратно прижмите защитное стекло к выровненным эмбрионам, перенесите защитное стекло с эмбрионами в коробку, содержащую адсорбент. Добавьте на них гало-углеродное масло. Чтобы сделать микроинъекцию эмбрионов, сначала загрузите два микролитра ДНК в иглу с помощью вытянутой пипетки.

Поместите выровненные эмбрионы с гало-углеродным маслом под перевернутый микроскоп. Затем с помощью микроманипулятора введите иглу в задние концы эмбриона. С помощью ножного регулятора осторожно введите ДНК в эмбрион.

Извлеките иглу после завершения микроинъекции первого эмбриона, затем переместите ее на задний конец следующего эмбриона. Перенесите введенные эмбрионы в агаровую тарелку для инкубации. Когда яйца вылупятся, приготовьте пузырек с едой.

Добавьте в флакон несколько капель дистиллированной воды. С помощью стереомикроскопа и кисти соберите вылупившихся личинок, затем перенесите их во флакон. Инкубируйте флакон при температуре 25 градусов Цельсия при влажности от 50% до 60% в течение 10 дней.

Пересушенные эмбрионы выглядят деформированными и не могут быть использованы для микроинъекций. Недосушенные эмбрионы пропускали большое количество цитоплазмы при пункции, тем самым снижая выживаемость. Правильно высушенные эмбрионы вытекали лишь в небольшом объеме, если таковые имелись, при введении.

Линия дрозофилы, экспрессирующая интегразу phiC31, используемую для микроинъекций эмбрионов, имела белые глаза. Возрастные мухи этого генотипа имеют розовые глаза, образующиеся в результате накопленного красного флуоресцентного белка, экспрессируемого специфически в глазу. Были успешно получены трансгенные мухи, несущие трансген в месте стыковки attP2 с оранжевыми глазами.