Для начала разморозьте тромбин и апротинин на льду и поместите флакон с фибриногеном на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью пипетки гомогенизируйте их под капотом. Затем с помощью стерильных плоскогубцев поместите вкладыши в культуральные лунки, оставив на тарелке хотя бы один столбец или ряд пустым.
В тюбик объемом 0,25 миллилитра сначала добавьте необходимые объемы фибриногена и апротинина. Далее добавьте в трубку тромбин и быстро промойте два раза, не создавая пузырьков. Прорисуйте все содержимое трубки.
Расположите пипетку вертикально над центром вкладыша и аккуратно промойте смесь реагентов, не образуя пузырьков. Инкубируйте не менее одного часа при температуре 37 градусов Цельсия для затвердевания, пока смесь не станет непрозрачной белой. Для засеивания органоидов подтвердите под микроскопом, что микромассы образуют сферические клеточные массы с компактным хором, окруженным гало более низкой плотности ранних предшественников тимуса.
Отрежьте кончик конуса P200 и промойте его раствором против пригаривания. Наклоните пластину почти в вертикальное положение и отсасывайте клеточные массы со дна лунки. Аккуратно нанесите массу на верхнюю часть гидрогелей, не касаясь геля.
Проверьте под микроскопом, чтобы в пластинчатых лунках не осталось органоида. Затем медленно добавьте четверть объема питательной среды в верхнюю часть гидрогеля, не касаясь его, и добавьте оставшиеся 3/4 на дно лунки. Добавьте один миллилитр PBS в пустые лунки для культуры для поддержания влажности в тарелке и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.
Органоиды образуют сферические или продолговатые структуры и иногда сливаются, образуя более крупные структуры в гидрогелях.
