Для начала получите изображения иммуноокрашенных срезов ГЦК. Скачайте и откройте QuPath 0.4.3. exe на компьютере.
Создайте новую папку с подходящим именем для организации проектов QuPath. Нажмите кнопку «Создать проект» в левом верхнем углу программы и выберите только что созданную папку. Затем перетащите отсканированные изображения в окно программного обеспечения QuPath.
Как только появится новое окно, выберите «Установить тип изображения» и нажмите H-DAB, а затем выполните импорт. Чтобы просмотреть импортированные изображения, проверьте список в левом окне меню и дважды щелкните по изображению, чтобы открыть его. Выберите файл в главном меню и перейдите к сохранению изображений как проект.
Выберите инструменты кисти или палочки в главном меню, чтобы аннотировать область опухоли. В случаях прерывистых областей опухоли аннотируйте каждую область отдельно. Нажмите и удерживайте клавишу управления во время выбора всех регионов.
Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Редактировать несколько», а затем выберите «Объединить выбранные». После этого нажмите «Автоматизировать» в главном меню и выберите «Показать редактор скриптов». Скопируйте нужный скрипт, вставьте его в редактор скриптов, затем нажмите кнопку «Выполнить».
В качестве альтернативы выберите инструмент «Полилиния» в главном меню, чтобы точно нарисовать границу, разделяющую гнезда злокачественных клеток и прилегающие неопухолевые ткани. Затем выберите границу в главном меню, выберите объекты, нажмите аннотацию и выберите развернуть аннотации. Установите радиус расширения на 500 микрометров и выберите плоский для колпачка линии.
Активируйте функцию «Удалить интерьер» и убедитесь, что активирована функция «Ограничить родительский элемент». Теперь щелкните правой кнопкой мыши по только что созданной аннотации. Выберите «Редактировать сингл» и выберите «Разделить».
Чтобы правильно назвать аннотированные регионы, щелкните правой кнопкой мыши аннотацию в списке слева. Выберите набор свойств и введите соответствующие имена для областей внутреннего и внешнего поля. Определите оставшуюся область опухоли в качестве центра опухоли.
Удлинение периопухолевой области шириной 500 микрометров, прилегающей к внешнему краю, как было показано ранее. Для детального анализа пикселей выберите инструмент «Прямоугольник» в главном меню. Затем добавьте заметку к области, охватывающей все типы пикселей, которые необходимо выделить.
Далее перейдите в главное меню. Выберите «Анализ» и нажмите «Предварительная обработка». Затем нажмите кнопку «Оценить вектор пятна».
После активации визуального редактора пятен выберите «Авто» и нажмите «ОК». Назовите предполагаемый вектор окрашивания H-DAB. Для пиксельного анализа альтернативный метод включает в себя использование инструмента «Прямоугольник» в главном меню, чтобы выделить небольшой участок ядра, окрашенный гематоксилином.
Далее откройте левое меню и выберите изображение. Затем дважды кликните по пятну и выберите «Да». Опять же, используйте инструмент прямоугольник для аннотирования небольшой области, показывая положительное окрашивание с помощью DAB.
После этого выберите изображение в левом меню и дважды кликните по пятну два, а затем «да». Чтобы оценить долю площади положительных иммунных клеток в главном меню, нажмите на опцию «Классифицировать», выберите классификацию пикселей и нажмите «Создать порог». После этого установите разрешение на высокое, выберите канал DAB и примените предфильтр Гаусса с сигмой 0,5.
Отрегулируйте пороговое значение в диапазоне от 0,2 до 0,3. Определите пиксели выше порога как положительные, а ниже порога как отрицательные. Для выбора региона выберите любую аннотацию.
Дайте классификатору имя. Затем нажмите «Сохранить», «Измерить» и «ОК». Чтобы задокументировать результаты, скопируйте результаты, отображаемые в левом боковом меню, и перенесите их в электронную таблицу.
Выберите меру в верхнем главном меню в качестве альтернативного метода. Затем выберите «Показать измерения аннотаций». Выберите «Копировать в буфер обмена» и вставьте эти результаты в электронную таблицу для подробного учета.
Наконец, щелкните правой кнопкой мыши изображение, перейдите в режим multi-view и нажмите «Закрыть просмотрщик», чтобы закрыть изображение. Белок CD117 преимущественно наблюдался в цитоплазматических мембранах округлых клеток в опухолевой строме и параваскулярных пространствах. CD117-положительные клетки также наблюдались в опухолевых капсулах и параваскулярных областях наружного края и параопухоли.
Белок NKp46 в основном наблюдался в цитоплазматических мембранах округлых клеток в синусоидоподобных пространствах, строме опухолевого центра и внутреннем крае. Nkp46-положительные клетки наблюдались в капсулах вокруг опухолевых гнезд и стромы портальных трактов на наружном крае и в периопухолевых областях. Белок CD1a в основном наблюдался в цитоплазматических мембранах округлых клеток, либо разрозненно, либо в агрегатах в строме и синусоидоподобных пространствах в центре опухоли и внутренней краевой области.
CD1a-положительные клетки были обнаружены в синусоидах и эпителии желчевыводящих путей в области параопухоли.
