Переваривание скелетных и сердечных мышц мышей для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток и культивирования фиброадипогенных предшественников (FAP)

Для начала добавьте два миллилитра буфера для пищеварения в пятимиллилитровый транспортный флакон, содержащий сердечную ткань мыши, и четыре миллилитра буфера для пищеварения в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую скелетную ткань мыши. Поместите сердцем и четырехглавой мышечной тканью, изолированные от колючей мыши, на крышку чашки Петри. С помощью ножниц для ткани измельчите его на кусочки размером менее одного кубического миллиметра.

Переложите измельченную ткань в соответствующие пищеварительные трубки. Вихревыми движениями перегнетайте содержимое пробирок в течение двух секунд на низкой скорости. Через 20 минут снимите трубки с вращателя.

Дайте кусочкам салфетки осесть. Используйте пипетку P 1000 для аспирации надосадочной жидкости. Перелейте надосадочную жидкость в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров, содержащие 20 миллилитров ледяного буфера FACS.

Долейте до соответствующих объемов метантенковые пробирки буфер для сбраживания. Инкубируйте их на ротаторе еще раз. После того, как мышцы подверглись еще одному раунду пищеварения, добавьте ледяной буфер FACS, чтобы утолить пищеварение.

Поместите сетчатый фильтр для клеток размером 40 микрометров поверх центрифуговой пробирки объемом 50 миллилитров. Отфильтруйте пищеваренную суспензию и супинируйте через ситечко. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия.

После удаления надосадочной жидкости добавьте в гранулу три миллилитра буфера для лизиса ACK и повторите. Выдержать суспензию в течение пяти минут на льду. Долейте объем до 40 миллилитров с помощью буфера FACS.

Снова центрифугируйте образцы при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После сцеживания надосадочной жидкости повторно суспендировать гранулу в 0,5 миллилитрах буфера FACS. Наконец, отфильтруйте суспензию через крышку сетчатого фильтра размером 40 микрометров, помещенную в пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном.