Начать культивирование 5 раз по 10 до пятой DF-1 клеток на лунку в шестилуночном планшете с DMEM с добавлением 10% FBS. Когда клетки достигнут 80% конфлюенции, выбросьте сыворотку, содержащую среду для клеточных культур. После трехкратной промывки клеток PBS добавьте в каждую лунку по два миллилитра бессывороточной среды для культивирования клеток, а затем раствор вируса IBDV.
После одного часа всасывания вируса трижды промойте клетки PBS и инкубируйте их в течение 24 часов с двумя миллилитрами DMEM с добавлением 2% FBS. Добавьте 500 микролитров трипсина на лунку, а затем два миллилитра DMEM с 10% FBS через одну минуту. Центрифугируйте клетки и осторожно удалите надосадочную жидкость.
После повторного суспендирования клеточной таблетки в PBS осторожно переведите трубку в течение трех секунд и центрифугируйте клетки, как описано ранее. С помощью гемоцитометра под микроскопом подсчитывают клетки для ресуспензии их в соответствующем объеме проточной цитометрии, окрашивая буфер и вихревая суспензию. Добавьте 100 микролитров одноклеточной суспензии в пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном.
Инкубируйте инфицированные IBDV клетки и имитируйте контрольные клетки с одним микрограммом соответствующего антитела на льду в течение 30 минут в темноте. Аккуратно проделывайте вихревую трубку каждые 10 минут. Промойте клетки одним миллилитром буфера для окрашивания проточной цитометрией и центрифугируйте пробирку.
После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера для окрашивания проточной цитометрией. Затем инкубируйте клетки с 10 микрограммами на миллилитр йодида пропидиума в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. И добавить 400 микролитров буфера для окрашивания проточной цитометрией для проведения анализа проточной цитометрии.
Выполните проточную цитометрию с помощью пустой контрольной трубки, а затем одинарно окрашенных пробирок для регулировки напряжения и параметров компенсации перед запуском всех образцов. Проточная цитометрия показала, что значительное количество клеток были положительными на N-концевые фрагменты куриного Gasdermin E после инфекции IBV, в то время как С-концевые фрагменты расщепленного куриного Gasdermin E были едва обнаруживаемы с помощью проточной цитометрии с использованием окрашивания мембранной поверхности антигена. Популяция N-концевых фрагментов куриных клеток Gasdermin E и пропидиума йодида с двойным положительным результатом в клетках, инфицированных IBDV, была значительно больше, чем в контрольной группе, что позволяет предположить, что эта часть инфицированных клеток IBDV подвергалась пироптозу.
