Для начала перенесите вырезанные яичники рыбки данио в шестилуночный планшет, содержащий два миллилитра раствора для диссоциации клеток. Инкубируйте яичники при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение двух-трех часов. Добавьте в буфер два-три миллилитра предварительно подогретой среды L15, чтобы остановить пищеварение.
Затем поместите сетчатый фильтр 70 микрометров в другую лунку шестилуночного планшета. Добавьте среду L15 в лунку, следя за тем, чтобы уровень среды был выше сетчатого фильтра. Теперь с помощью пипетки протяните пищеварительную среду через клеточный фильтр.
Удалите излишки среды с помощью пипетки. Добавьте в лунку четыре миллилитра свежей среды L15, и аккуратно суспендируйте ооциты. Через пару минут выведите надосадочную жидкость пипеткой.
Чтобы отобрать ооциты для контроля качества, переложите их в чашку шириной 35 миллиметров, содержащую свежую среду L15. Наблюдайте за ооцитами под световым микроскопом с увеличением 10X и более. Используйте тупой инструмент для инъекции, чтобы удалить любые фрагменты клеток, ооциты первой стадии или ооциты любой другой стадии.
Для подтверждения стадии роста добавьте Hoechst 33342 в среду L15, содержащую ооциты, и инкубируйте. Наблюдайте за ооцитами с помощью флуоресцентного микроскопа под воздействием УФ-лазера. Тщательно отбирайте иглой яйцеклетки, которые не соответствуют нужным критериям.
Ювенильный яичник показал обилие прозрачных ооцитов первой стадии, сопровождающееся меньшей популяцией ооцитов второй стадии. Яичники взрослых рыб показали преобладание непрозрачных ооцитов поздней стадии 2-3. Референтный метод привел к появлению многочисленных окрашенных гранулезных клеточных ядер на поверхности ооцитов, плотно обволакивающих ооциты.
В отличие от этого, модифицированный метод позволил отделить ооциты первой стадии, лишенные окрашивания гранулезных клеточных ядер.
