Окрашивание антиген-специфических Т-клеток тетрамерами пептид:МНС для анализа и сортировки методом проточной цитометрии

После обогащения образца легких на Т-клетки добавьте в каждый образец по одному миллилитру 10 миллимолярного дазатиниба. Ввергните смесь в вихрь и выдержите пять минут при комнатной температуре. Добавьте PE или APC конъюгированный пептид тетрамер MHC до конечной концентрации 10 наномоляров.

После вортексования смеси выдержите ее в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. В то время как образец окрашивают пептидными тетрамерами MHC, готовят мастер-смесь антител для окрашивания маркеров клеточной поверхности за 15 минут, оставшихся до инкубационного периода окрашивания тетрамеров, добавляют мастер-смесь поверхностных антител в разведении от 1 до 100. Добавьте 50 000 шариков проточной цитометрии и буфер для холодной сортировки, чтобы получить конечный объем примерно в пять миллилитров, затем добавьте буфер для холодной сортировки до объема 15 миллилитров и центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя примерно 100 микролитров надосадочной жидкости и клеточную гранулу. Теперь повторно суспендируйте образец с помощью дополнительных 200 микролитров буфера для сортировки и переложите его в пятимиллилитровую пробирку FACS.