Для начала добавьте 50 микролитров микрогранул CD90.2 против мышей в изолированные клетки легких. После вортексирования смеси выдерживайте ее в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Затем поместите парамагнитную разделительную колонку на одно- или четырехпозиционный разделительный магнит.
Поместите открытую коническую трубку объемом 15 миллилитров под каждую колонну, чтобы улавливать поток. Заправьте колонну тремя миллилитрами буфера для холодной сортировки, позволив колонне под действием силы тяжести стекать в коническую трубу внизу. После того, как клетки инкубируются с микрогранулами в течение 10 минут, добавьте холодный буфер сортировщика в объеме одного миллилитра и пропустите смесь через 100-микрометровое сетчатое фильтр, расположенное на вершине колонны.
Соберите проточный поток колонны в свежую коническую трубку объемом 15 миллилитров, помещенную ниже колонны. После того, как клеточная суспензия полностью просочится через колонну, добавьте еще три миллилитра холодного сортировочного буфера в исходную пробирку и нанесите его на колонку через сетку перед снятием сетчатого фильтра. Когда образец полностью стекает в колонку и через нее больше не происходит, снимите колонку с магнита и поместите ее на свежую коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Добавьте в колонку пять миллилитров буфера холодного сортировщика. Чтобы элюировать связанные ячейки, нажмите на поршень колонки вниз одним непрерывным движением, выталкивая буфер из дна в новую трубку. Центрифугируйте элюированные образцы при 400 x g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя примерно 100 микролитров надосадочной жидкости и клеточную гранулу. В среднем, в процессе обогащения извлекается более 99% всех CD90.2-положительных Т-клеток из легких с чистотой более 90%.
