Для начала добавьте 1,5 миллилитра 70% этанола к 30 миллиграммам частиц вольфрама размером 0,7 микрометра в микропробирке. Центрифугируйте смесь при температуре 13, 200G в течение 15 минут. Добавьте к частицам 1,5 миллилитра стерильной воды, затем сделайте вихрь и снова центрифугуйте.
Выбросив надосадочную жидкость, добавьте к частицам вольфрама 500 микролитров стерильного 50% глицерина. Чтобы покрыть частицы, сначала добавьте пять микрограммов двухмикронной плазмиды и 15 микрограммов бактериальной плазмиды, содержащей митохондриальную последовательность, в микротрубку, помещенную на лед. Добавьте в трубку 100 микролитров суспензии вольфрамовых частиц и сделайте вихрь.
Затем добавьте четыре микролитра одномолярного спермидина и снова вортекс. Теперь пипеткой внесите в пробирку 100 микролитров ледяного 2,5-молярного хлорида кальция. После кратковременного воркшения суспензии, инкубируйте ее на льду в течение 10 минут.
Центрифугируйте частицы вольфрама при температуре 13, 200G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия. Затем промойте частицы в 200 микролитрах 100% этанола при температуре минус 20 градусов Цельсия. Наконец, повторно суспендируйте частицы вольфрама в 60-70 микролитрах 100% этанола комнатной температуры.
Чтобы подготовить биолистические материалы, поместите шесть стерилизованных держателей макроносителей на стерильную стеклянную тарелку. С помощью пары стерильных щипцов вставьте макроносители в каждый из шести держателей макроносителей. Нанесите пипеткой 10 микролитров ДНК-кодированных частиц вольфрама на каждую поверхность макроносителя и равномерно распределите по всей поверхности с помощью наконечника для дозатора.
Ввести штамм рецептора дрожжей rho zero в два миллилитра среды YPR. Выращивайте культуру за ночь при 30 градусах Цельсия во вращающемся колесе. На следующий день перелейте 300 микролитров культуры в пробирку, содержащую 30 миллилитров свежей среды YPR.
Поместите культуру на вращающийся шейкер на две ночи при температуре 30 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту, пока культура не пропитается. Центрифугируйте дрожжевые клетки при температуре 600G в течение пяти минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в 600 микролитрах среды YPD после отбрасывания надосадочной жидкости.
Теперь с помощью стерильной стеклянной ручки распределите 100 микролитров суспензии дрожжевых клеток на твердой средней тарелке для бомбардировки. После разброса всех культур инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение одного-трех часов до бомбардировки.
