Развитие чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток с помощью лентивирусной трансдукции

Для начала поместите пузырек с криоконсервированными мононуклеарными клетками периферической крови человека в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. После размораживания перенесите суспензию PBMC в 15-миллилитровую пробирку, содержащую девять миллилитров TGM. Центрифугируйте пробирку при 300 G в течение пяти минут после пипетирования аликвоты клеточной суспензии для подсчета.

Повторно суспендируйте гранулированный PBMC в трех миллилитрах TGM. Затем переведите необходимый объем клеточной суспензии в шестилуночную пластину. За день до реанимации клеток перенесите 100 микролитров магнитных шариков иммуноглобулина G мыши в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте в пробирки один миллилитр PBS и поместите их на магнитную подставку для мытья бусин. Повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах PBS. Затем добавьте антитела в суспензию.

С помощью пипетки аккуратно хорошо перемешайте суспензию. Поместите подвес на коромысло при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. После промывки бусин в PBS, как это было сделано ранее, снова суспендируйте их в 100 микролитрах PBS.

Теперь добавьте в тарелку иммуношарики, покрытые NHCD3 hCD28, и инкубируйте. После 48 часов инкубации смешайте и переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Поместите трубку на магнитную подставку на три минуты.

Затем переложите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую трубку. Высевают пять раз по 10 в степени пяти ПБМК по 300 микролитров ТГМ в лунки 48 луночной плоской пластины. Пипеткой внесите 200 микролитров чечевичного запаса в соответствующие лунки.

Затем добавьте сульфат протамина до конечной концентрации 10 микрограмм на миллилитр перед центрифугированием. Выведите пипеткой по 300 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки, затем добавьте по одному миллилитру свежего ТГМ в каждую лунку. Поместите планшет во влажный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия под содержанием углекислого газа 5%.

Добавляйте в тарелку от 0,5 до двух миллилитров ТГМ раз в два-три дня. Затем переложите клетки в 12-луночный планшет, а затем в шестилуночный планшет до тех пор, пока общая плотность клеток не достигнет 6 миллионов в объеме четыре миллилитра.