Проточная цитометрическая оценка кислородзависимой экспрессии CAR в CAR-T-клетках

Для начала поместите культивируемые CAR-трансдуцированные Т-клетки в два 12-луночных планшета, содержащих два миллилитра TGM. Поместите одну тарелку непосредственно во увлажненный инкубатор с содержанием углекислого газа 5% при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите другую пластину в мобильную камеру инкубатора с углекислым газом и кислородным азотом с заданным уровнем кислорода 1%Собирайте 500 000 клеток с планшетов каждые 24 часа при обоих условиях в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки.

Центрифугируйте пробирки при 500 G в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости аккуратно пипеткой введите один миллилитр PBS в клеточную гранулу. Ресуспендируйте гранулированные элементы в 50 микролитрах буфера FACS.

Затем добавьте 50 микролитров одного к 100 разведению конъюгированного фикоэритрина антифлагового антитела. Пипеткой суспензию тщательно перемешать. После инкубации добавьте по одному миллилитру буфера FACS в каждую пробирку.

Центрифугируйте смешанную суспензию при 500 G в течение пяти минут. Теперь выведите надосадочную жидкость из каждой пробирки. Затем ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах буфера FACS.

Полученную клеточную суспензию переложите в пятимиллилитровые пробирки проточной цитометрии. Проведите проточную цитометрию клеточной суспензии для определения экспрессии поверхностных химерных антигенных рецепторов. Установите новые трубки как заготовку и CAR.

Нажмите Каналы FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE и FITC. Затем создайте четыре точечные диаграммы для последовательной идентификации отдельных клеток, живых клеток, GFP-положительных и PE-положительных клеток. Задайте параметры для сбора 10 000 одиночных живых клеток.

Нажмите Получить данные. После того как сбор ячеек стабилизируется, нажмите кнопку «Записать данные». Чтобы определить расположение ворот в соответствии с отрицательным контролем, затворите клетки, положительные на EGFP и фикоэритрин, чтобы измерить фикоэритриновую положительную способность и медианную интенсивность флуоресценции.

Чувствительный к гипоксии per two нацеленный на CAR показал значительно высокую экспрессию CAR в условиях гипоксии по сравнению с нормоксическими условиями.