Для начала получите 250 мг SAT над большой грудной мышцей во время имплантации CIED в магнитно-активируемом растворе для сортировки тканей клеток. Приготовьте один миллиграмм на миллилитр коллагеназы/диспазы в 10 миллилитрах холодного раствора сбалансированной соли Хэнкса. Под ламинарным шкафом измельчите салфетки на кусочки объемом в один кубический миллиметр в 500 микролитрах раствора Коллагеназы/Диспазы.
Добавьте в смесь 4,5 миллилитров раствора коллагеназы/диспазы и переложите разтертую ткань в чистую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Вымойте крышку чашки Петри пятью миллилитрами раствора коллагеназы/диспазы и добавьте его в тюбик. Инкубируйте трубку в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в ротаторе трубки, установленном на 20 оборотов в минуту.
Чтобы остановить пищеварение, налейте в пробирку 10 миллилитров полной среды для роста эндотелиальных клеток. После растирания переваренной смеси с помощью венфлоновой канюли 14-го калибра процедите ее через клеточное сито с толщиной 70 микрометров и промойте 10 миллилитрами 0,5% буфера PBS-BSA. Центрифугируйте фильтрат при 300G в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
Чтобы удалить мертвые клетки, добавьте 200 микролитров гранул для удаления мертвых клеток в клеточную гранулу, взятую в микроцентрифужную пробирку, и инкубируйте. Затем прикрепите к магниту-сепаратору колонку для разделения жидкости с фильтром на 30 микрометров и поместите под нее центрифужную трубку объемом 15 миллилитров. После промывки колонки связывающим буфером для удаления мертвых клеток, добавьте образец суспензии гранул.
Пропустите его под действием силы тяжести и соберите элюат. Далее открутите собранную живую клетку, элюируйте и ресуспендируйте полученную гранулу в 400 микролитрах 0,5%-ного PBS-BSA. Инкубируйте взвешенные клетки с 20 микролитрами магнитных шариков, покрытых анти-CD31, при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.
После центрифугирования суспендировать клеточную гранулу в 500 микролитрах 0,5% PBS-BSA. Прикрепите к магниту-сепаратору колонку с фильтром на 30 микрометров и поместите под нее центрифужную трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте суспензию микрогранул клеток в колонку и пропустите ее под действием силы тяжести.
После промывки колонки поместите ее в свежую 15-миллилитровую центрифужную пробирку и добавьте в колонку один миллилитр 0,5% PBS-BSA. Нажмите на поршень колонны, чтобы собрать CD31-положительную фракцию. Центрифугируйте образец, как было показано ранее, и ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре полной микрососудистой среды для роста эндотелиальных клеток.
Раздайте суспензию в две лунки 24-луночного планшета, покрытого 2% желатином. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение двух-четырех недель, пока клетки не станут почти на 80% сливающимися.
