Для начала скачайте и установите на компьютер последнюю версию Fiji. После скачивания convert_to_TIFF. py, перетащите скрипт на Фиджи и запустите код.
Перейдите к пути, в котором хранится эксперимент. Преобразованные файлы TIFF создаются в одной экспериментальной папке. Нажмите на плагины, затем 3D Suite и откройте опции 3D-менеджера.
В окне 3D-менеджера установите флажки, соответствующие объему в единицах, среднему значению серого, ограничивающему прямоугольнику в пикселях, среднеквадратическому отклонению серого, центроиду в пикселях и центроиду в единицах измерения. Отметьте галочкой опции «Исключить объекты на ребрах XY» и «Исключить объекты на ребрах Z». Затем нажмите кнопку «ОК». Откройте флуоресцентное изображение Т-лимфоцитов человека.
Нажмите Control Shift D, чтобы дублировать белковый канал, включая стек. Установите флажок hyper stack. Укажите соответствующий номер канала в поле каналов и переименуйте его соответствующим образом.
Чтобы запустить рекордер макросов Fiji, перейдите к плагинам, затем к макросам и выберите запись. Затем, чтобы открыть плагин FindFoci, последовательно нажмите на плагины GDSC, FindFoci и FindFoci GUI. В выпадающем меню изображения выберите изображение для анализа.
Установите размытие по Гауссу на 1.5, метод фона на стандартное отклонение выше среднего, параметр фона на девять, метод поиска на долю пикового фона, параметр поиска на 0.7, пиковый метод на относительный над фоном, пиковый параметр на 0.2 и минимальный размер на пять. Установите максимальные пики на высокие числа, чтобы включить все фокусы на изображении. Чтобы улучшить идентификацию фокусов, настройте размытие по Гауссу близко к диаметру фокусов и увеличьте значения параметра фона, чтобы установить более строгие пороговые значения.
Затем уменьшите значения параметра поиска, чтобы включить области, удаленные от пика флуоресценции, и уменьшите значения параметра peak для разделения пиков. Запустите FindFoci и скопируйте строку, которая появится в окне регистратора. Строка содержит выбранные параметры, за исключением кавычек.
После загрузки скрипта nuclear_prod_q. py перетащите скрипт на Фиджи и нажмите «Выполнить», чтобы выполнить код. В поле Канал ядра введите число, соответствующее каналу DAPI.
Для ядра Гауссова размытия введите значение сигма, необходимое для размытия изображения для сегментации. Затем введите число, соответствующее интересующему каналу окрашивания для белкового канала. В параметр FindFoci вставьте строку, представляющую запись в макросе выбранных параметров.
Установите флажок визуального элемента и нажмите кнопку Обзор, чтобы выбрать каталог, в котором хранятся изображения. После того как все поля будут скомпилированы, нажмите OK, чтобы продолжить выполнение. В списке ROI в 3D-окне Диспетчер ROI выберите канал ядер и нажмите кнопку Вкл.
Выберите ROI, принадлежащий тому же ядру, и нажмите «Объединить». А для нежелательных ядер нажмите клавишу Delete. Снова нажмите Live ROI для включения, выберите все и убедитесь, что все ядра правильно сегментированы.
В папке количественного определения откройте файл TXT с записями параметров, использованных для анализа. Откройте Google Colab в браузере. Затем в файле выберите «Открыть блокнот» и загрузите окончательные метрики ядерного белка.
Скрипт IPYNB. Загрузите все папки, содержащие CSV-файлы каждого поля изображения, в нужную папку на Google Диске. В записной книжке укажите путь к папке, в которой хранятся подпапки с результатами, и запустите все ячейки.
Когда компиляция кода будет завершена, откройте окончательный файл таблицы, содержащий все скомпилированные данные.
