Для начала промойте свежий образец атриума человека в 100-миллиметровой стеклянной пластине, содержащей стерильный HBSS. Аккуратно встряхните образцы в тарелке, чтобы удалить остатки крови. Перенесите образец на 100-миллиметровую пластину, смоченную небольшим объемом HBSS.
Скрещенными скальпелями измельчите образец на кубики размером два миллиметра. Далее перенесите четыре небольших фрагмента миокарда на 35-миллиметровую пластину. Накройте фрагменты стерильным покровным стеклом и слегка надавите.
Пипеткой внесите 1,5 миллилитра DMEM в тарелку. Затем инкубируйте культуральные планшеты при температуре 37 градусов Цельсия с добавлением 5% углекислого газа. Когда посевы достигнут 85% конфлюенции, выньте планшет из инкубатора и с помощью стерильных щипцов приподнимите покровное стекло.
Затем положите его вверх ногами на новую 35-миллиметровую пластину. Затем добавьте стерильный PBS, чтобы промыть его. Теперь удалите фрагменты миокарда.
Затем выведите пипетку DMEM из тарелки. Используйте стерильный PBS для промывки пластины, содержащей переросшие клетки. Выбросив ополаскиватель, добавьте по одному миллилитру 0,25% трипсина ЭДТА в каждую тарелку и выдерживайте пластины при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение пяти минут.
После инкубации извлеките планшеты из инкубатора и с помощью микроскопа подтвердите отслоение клеток. Затем добавьте два миллилитра раствора трипсина, или TSS, в каждую пластину, чтобы блокировать трипсинизацию. Переложите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте его при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки. Затем добавьте в гранулу три миллилитра DMEM и снова суспендируйте ее.
Поместите клеточный подвес на 60-миллиметровую пластину. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, при добавлении 5% углекислого газа. Далее пипеткой нанесите три миллилитра стерильного 0,2%-ного раствора желатина на каждую 60-миллиметровую пластину.
После инкубации отсадить раствор и добавить три миллилитра стерильного PBS до дальнейшего использования. Достаньте из инкубатора пластину, содержащую сердечные фибробласты. Снимите DMEM с тарелки и промойте стерильным PBS.
Выбросив полоскатель, добавьте по одному миллилитру 0,25% трипсина ЭДТА на каждую тарелку. Используйте микроскоп, чтобы подтвердить отслойку клеток. Далее добавьте по два миллилитра TSS в каждую пластину, чтобы блокировать трипсинизацию.
Переложите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте его при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки.
Затем добавьте в гранулу три миллилитра DMEM и снова суспендируйте ее. Извлеките PBS из 60-миллиметровой пластины, покрытой желатином, и поместите клеточную суспензию в пластину. Культивируйте фибробласты в состоянии слияния в течение 21 дня.
После 21 дня культивирования аспирируйте питательную среду. Затем промойте тарелки тремя миллилитрами PBS. После аспирации PBS и добавления одного миллилитра раствора для децеллюляризации рассмотрите пластину под инвертированным контрастным микроскопом.
Через две минуты аккуратно пипеткой наберите четыре миллилитра PBS, чтобы развести раствор децеллюляризации в пластинах. Отсадите разведенный раствор. Затем аккуратно промойте пластины PBS.
Наконец, добавьте в тарелки один миллилитр PBS. Храните пластины, покрытые внеклеточным матриксом, при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшего использования. Отрастание фибробластов из мелких фрагментов нативного миокарда, помещенных в культуру, наблюдалось в течение трех-пяти дней.
В результате децеллюляризации на поверхности пластины образуется покрытие внеклеточного матрикса. Состав и архитектура внеклеточного матрикса сердца, произведенного in vitro, были сохранены за счет децеллюляризации.
