Загрузка первичных CD4⁺ Т-клеток мыши и покрытие магнитных шариков белка G антителами для локальной визуализации Ca²⁺

Для начала возьмите CD4-положительные Т-клетки, выделенные из лимфатических узлов и селезенки мыши. Центрифугируйте от двух до пяти миллионов клеток в течение пяти минут при 300 g. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 480 микролитрах Т-клеточной среды, содержащей 10 микромоляров Fluo-4 AM и 20 микромоляров Fura Red AM. Накройте трубку Falcon алюминиевой фольгой и инкубируйте клетки в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.

Затем добавьте к клеткам два миллилитра Т-клеточной среды и продолжайте инкубацию еще 30 минут. Аккуратно перемешайте магнитную суспензию Protein G и перелейте 12,5 микролитров в новую пробирку. Поместите трубку на магнитную подставку, чтобы бусины могли мигрировать к магниту.

Аккуратно извлеките буфер для хранения с противоположной стороны магнита, чтобы извлечь его. Чтобы удалить оставшийся буфер хранения, добавьте 500 микролитров PBST и вортекс на 10 секунд. Снова поместите трубку на магнитную подставку и снимите буфер.

Чтобы покрыть шарики антителами, повторно суспендируйте их в 7,5 микролитрах PBST и добавьте по пять микролитров анти-CD3 и анти-CD28. Инкубировать от 30 до 60 минут при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. Промойте покрытые бусины три раза 500 микролитрами PBST, затем промойте 500 микролитрами буфера кальция с помощью магнитной подставки, затем повторно суспендируйте бусины в 200-400 микролитрах буфера кальция.