Обнаружение микродоменов Ca²⁺ на субклеточном уровне в первичных мышиных Т-клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Для начала поместите 10 микролитров загруженных CD4+ элементов на подготовленное предметное стекло и дайте им прикрепиться на три-пять минут. Аккуратно добавьте в предметное стекло 80 микролитров кальциевого мерного буфера. Выберите 100-кратную масляную иммерсионную линзу.

Нанесите небольшую каплю иммерсионного масла и поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа. Затем отрегулируйте фокусировку в режиме светлого поля. Выберите поле зрения, содержащее до 10 ячеек, которые не соприкасаются друг с другом, и получите изображение.

Затем добавьте 10 микролитров гранул или стимулятора, покрытых антителами, через одну минуту и измеряйте в общей сложности три минуты, используя 40 кадров в секунду или максимально возможную частоту кадров. Используйте ползунок, чтобы точно определить время контакта между бусиной и интересующей клеткой. В меню «Параметры» справа выберите контакт борта: x, y, t.

Выберите место в левой части изображения, где клетка и бусина соприкасаются. Выберите Выбрать ячейку, щелкнув точку внутри. Кликните по стимулируемой этой бусиной ячейке, желательно в центре.

Нажмите на кнопку ДОБАВИТЬ контакт с шариком. После того, как все контакты бусин определены, нажмите кнопку «Продолжить» и перейдите к работе с дополнительными файлами В клетках типа «Вайлд» в течение первой секунды после стимуляции наблюдалось быстрое образование микродомена кальция, который распространялся по всей клетке в течение последующих 15 секунд. И наоборот, мутантные клетки P2x4 и P2x7 показали снижение образования микродомена кальция, а мутантные клетки P2x4 также демонстрировали более низкий базальный уровень до стимуляции.

Как и у мышиных Т-клеток, в CD4+T-клетках человека наблюдались микродомены кальция в месте контакта с шариками.