Для начала культивируйте МСК в шестилуночном планшете со средой МСК человека, содержащей 1% пенициллина и стрептомицина. Затем приступают к мечению клеток ARPE19 Mito-RFP следами фиолетового в цитоплазматической мембране. Для этого добавьте 20 микролитров диметилсульфоксида во флакон реагента Cell Trace Violet и хорошо перемешайте непосредственно перед использованием.
Вырастите ячейки ARPE19 Mito-RFP до желаемой плотности от 80 до 90%Чтобы приготовить загрузочный раствор, разбавьте стоковый раствор клеточных следов фиалки в предварительно подогретом DPBS. Затем извлеките питательную среду из клеток и замените ее одним миллилитром загрузочного раствора. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
По окончании инкубации извлеките загрузочный раствор. Промыв клетки два раза DPBS, добавьте два миллилитра свежей, полноценной среды. Затем инкубируйте клетки в течение не менее 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить клеточному фиолетовому следу подвергнуться гидролизу ацетата.
Затем приготовьте пластину на 24 лунки, добавив в каждую лунку по 50 микролитров DPBS. Вставьте покровное стекло в тарелку и дайте ему отстояться в течение одной минуты. Извлеките DPBS из лунок под отрицательным давлением, чтобы убедиться, что заслонка крышки находится близко ко дну чашки.
Как только плотность клеток достигнет 80-90%, удалите исходную среду и промойте клетки один раз DPBS, добавьте один миллилитр смеси трипсина EDTA DPBS и инкубируйте в течение трех-четырех минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем осторожно постучите по шестилуночной пластине, чтобы отделить прилипшие клетки. Добавьте один миллилитр свежей, готовой среды, чтобы завершить пищеварение.
После этого аккуратно суспензируйте все клетки с помощью пистолета-пипетки и переложите все собранные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Теперь центрифугируйте клетки при 200 G в течение пяти минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре свежей среды.
Поместите 10 микролитров клеточной суспензии на счетную пластину для подсчета. После посева МСК и клеток ARPE19 в 24-луночный планшет рассмотрите клетки под микроскопом. Встряхивайте пластину до тех пор, пока ячейки не будут равномерно распределены.
Инкубируйте их в культуре в течение 24 часов. Для непрямого совместного культивирования см. 10 000 клеток ARPE19 в 500 микролитрах среды на лунку 24-луночного планшета. Поместите вставку в лунку, где были засеяны клетки.
Засейте 10 000 мезенхимальных стволовых клеток в 100 микролитрах среды в верхней клеточной камере на лунку.
