Для начала получите образец смонтированного предметного стекла после его состаривания. Для предварительной обработки предметного стекла опустите его серийно в коплиновые банки, содержащие соответствующие растворы, на указанное время. Переварите ткань с помощью от 100 до 200 микролитров буфера для пищеварения протеиназы К и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты.
Чтобы остановить пищеварение, немедленно погрузите предметное стекло последовательно в растворы этанола на две минуты каждый. Нанесите на предметное стекло смесь для гибридизации FISH и накройте образец покровным стеклом. Поместите предметные стекла на горячую плиту, такую как система гибридизации Slide Moat при температуре 75 градусов Цельсия, на две-пять минут.
Затем перенесите предметное стекло на другую горячую плиту, установленную при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы гибридизироваться на ночь. Далее опустите предметное стекло в теплый буфер для стирки и осторожно снимите крышку. Вымойте и испачкайте предметное стекло соответствующими реагентами в темноте.
Быстро опустите горку в деионизированную воду не более чем на одну секунду и положите ее на бумажное полотенце. После высыхания закрепите затвор с помощью монтажного материала, препятствующего выцветанию. Установите крышку и заклейте ее лаком для ногтей перед визуализацией.
Используя масляный объектив с 60-кратным увеличением, захватывайте флуоресцентный сигнал в нескольких Z-стеках. Наконец, выполните максимальную 3D-проекцию для достижения наилучшего разрешения и примените деконволюцию или другие алгоритмы очистки фона. В образцах с тройным негативным раком молочной железы ядерный FISH в основном показывает две отдельные точки на ядро, представляющие два сигнала ERBB2.
Напротив, HER2-положительные образцы демонстрируют обильные сигналы FISH, указывающие на различные паттерны амплификации генов. Кроме того, некоторые ядра в HER2-положительных образцах могут демонстрировать кластеры, указывающие на дополнительные хромосомные концентраторы ДНК, которые являются фокусными точками для увеличения амплификации генов.
